细胞工程

发布时间:2015-05-07 来源: 民族团结细胞工程

第一篇:细胞工程

细 胞 工 程 CELL ENGINEERING ——改造和培养 细胞、组织、器官、个体的工程 刘广发 《细胞工程》主要内容(1) ? ? ? ? ? ? ? 细胞工程的基础知识与基本技术; 植物组织培养; 悬浮细胞培养和次生代谢物生产; 花药及单倍体植株培养; 原生质体制备与细胞融合; 人工种子制备; 植物脱病毒技术; 2 《细胞工程》主要内容(2) ? 动物细胞与组织培养 ? 动物细胞融合 ? 细胞重构与动物克隆 ? 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 ? 染色体转移与基因转移 ? 人类干细胞研究 ? 原核细胞的原生质体融合 ? 真菌细胞的原生质体融合 3 参考文献 ? 自编. 细胞工程讲义 ? 罗立新等. 细胞工程. 华南理工大学出版 社,2003 ? 李志勇编著. 细胞工程. 科学出版社, 2003 4 探究式自主学习计划 ? ? ? ? ? ? 自愿组成学习小组,3人左右,选出组长; 每组选一个主题,时间约10 min; 各组需准备PowerPoint; 各组最高可得8分; 其他同学可提问、补充或更正; 教师讲评和讨论; 5 探究式自主学习安排(已选) 顺序 1 2 3 4 5 6 7 8 课 题 学习小组 单倍体植物的诱发和利用 动物细胞融合 植物脱病毒技术 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体 人类干细胞研究 罗应学 高嘉 周立 蒙冰 王恒 细胞重构与动物克隆 杨欣蔷 6 探究式自主学习安排(2) 课 题 顺序 8 动物细胞与组织培养 9 动物细胞融合 10 细胞重构与动物克隆 学习小组 11 12 13 14 15 染色体转移与基因转移 人工种子制备 原生质体制备与细胞融合(植物) 原核细胞的原生质体融合 真菌细胞的原生质体融合 7 细胞工程的三个层次 ? 细胞水平:细胞培养, 细胞融合,整株培 养; ? 细胞器水平:细胞核,染色体,各细胞 器; ? 基因水平:基因转化; 8 开展细胞工程的意义 ? 研究各种细胞、组织和器官所需的生理条件及 其特点; ? 有利于改变物种的遗传种性,加快选育优良品 种的步伐; ? 可大量、不受季节限制地工厂化生产所需的组 织或生物; ? 有利于某些药物、抗体及次生代谢物的生产; ? 可获得脱毒植物; 9 第一章 细胞工程发展简史 一. 植物细胞工程 ? 1902 德国植物学家Harberlandt预言植物细胞具 全能性; ? 1904 德国胚胎学家Hanning成功培养萝卜胚并长 成植株; ? 1922 Robbins以豌豆等的茎尖在培养基上形成缺 绿的叶和根; ? 1930-34 李继侗发现银杏胚乳提取物能促进银杏 胚正常生长; ? 1934 美国White成功培养番茄离体根,发现愈靠 10 根尖病毒愈少; 植物细胞工程 ? 1935-36 中国罗宗洛父子发现嫩桑叶可促进玉 米离体根生长; ? 1937 美国White发现Vit B促进离体根生长, 指出IAA能调控生长; ? 1937 美国Michel首创用0.5M NaNO3融合两个 植物细胞原生质体; ? 1941 Overbeek以椰子乳加入培养基,成功培 养曼佗罗幼胚; ? ? Skoog和崔澄发现腺嘌呤等能诱导芽生成, 指出腺嘌呤与生长素之比,比例高则生芽,比 例低则生根; 11 植物细胞工程 ? 1956 Miller发现激动素,证明其促芽能力是腺嘌呤的 三万倍; ? 1958 Steward进行胡萝卜细胞悬浮培养,还长成胚状体 和植株; ? 1953 Muir成功对烟草细胞进行悬浮液体培养; ? 1960 英国Cocking用纤维素酶制备番茄根细胞原生质体; ? 1964 印度Maheshwari以花药培养出单倍体组织; ? 1968 Reinhard用植物细胞悬浮培养生产出哈尔碱; 12 植物细胞工程 ? 1972 Carlson用NaNO3成功融合不同烟草 的原生质体; ? 1977 Kao(高国南)首创PEG- 高钙高pH 值细胞融合法; ? 1978 Melchers获“番茄-马铃薯”杂种植物; ? 1985 Kitto研制出胡萝卜人工种子,美国、 日本和法国相继开展 人工种子研制; 13 二. 动物细胞工程 ? 1885 Wilhelm取出鸡胚髓板,在盐水中存活数天; ? 1903 Jolly将蝾螈的白细胞在悬滴中保存1个月; ? 1907 美国Harrison培养的蛙神经存活数周,且长 出轴突; ? 1914 Tomson创立能在培养基中维持器官小块的 方法; ? ? Carrel发现鸡胚浸出液明显促进细胞生长, 使鸡胚心脏细胞传代3400次,生存34年,可无限 生长; 14 动物细胞工程 ? 1940 Earle建立可无限传代的小鼠结缔组 织L系; ? 1951 Gay建立第一个永生人宫颈癌Hela 细胞系; ? 1958 冈田善雄用灭活仙台病毒诱发腹水 瘤细胞融合; ? 1960s 童第周和牛满江进行鱼和蛙的核移 植,获核质杂种鱼; 15 动物细胞工程 ? ? ? ? 1960 Barski成功进行小鼠细胞融合实验; 1965 Harris用灭活仙台病毒成功融合不同动物细胞; 1967 Weiss发现在人-鼠杂种细胞中,人染色体先丢失; 1975 Kohler & Milstein创立淋巴细胞杂交技术,获单克 隆抗体; ? 1997 英国Willmut以体细胞成功克隆“Dolly”羊; ? 1998年,人类胚胎干细胞被首次培养成功; ? 1999年,日本医学家宣布,实现人肝细胞在体外增殖; 16 第二章 细胞工程的基础知识与基本技术 一. 基础知识 1. 原核细胞:DNA裸露,生长迅速,易 于操作;但具细胞壁,表达真核基因 受一定限制。

2. 真核细胞:接近人类需要,但具细胞 周期,要同步化培养;生长慢,植物 细胞和真菌细胞具细胞壁。 17 二.基本操作 1. 无菌操作概念与技术 无菌室布局、卫生、消毒、超净台 18 基本操作 2.细胞培养 取样 灭菌 培养 传代 除菌 取样 3. 细胞融合 原生质体 融合 筛选 4. 转基因细胞(个体) 收获 19 第三章 植物细胞工程 主要内容: ? ? ? ? ? ? 植物组织培养; 悬浮细胞培养和次生代谢物生产; 花药及单倍体植株培养; 原生质体制备与细胞融合; 人工种子制备; 植物脱病毒技术; 20 第一节 植物组织培养 在无菌和人工控制营养及环境条件 下研究植物的细胞、组织和器官以及控 制其生长、发育的技术。

全世界通过植物细胞培养再生成植 株已超过600种,已使许多具有重要经济 价值的果树、药材、蔬菜和花卉等实现 商品化生产。 21 植物组织培养过程 离体的植物 脱分化 器官、组织、 细胞 愈 伤 组 织 再分化 芽 培养 根 植 物 体 22 植物组培基本过程 23 预备阶段(1) 配MS培养基 1.基本组分:mg/L 蔗糖 3% , KNO3 1900, NH4NO3 1650, CaCl2 440, MgSO4 370, KH2PO4 170, 2.微量无机物:Na2?EDTA 37.3, FeSO4 27.8, MnSO4 22.3, ZnSO4 8.6, H3BO3 6.2, KI 0.83, Na2MoO4 0.25, CoCl2 0.025, CuSO4 0.025 3.微量有机物:mg /L 肌醇 100, 腺嘌呤 5, 甘氨酸 2,烟酸 0.5, 吡咯醇 0.5,硫胺素 0.1,生物素 0.01, 激动素(KT) 0.04—10 吲哚乙酸(IAA) 1—30 24 4. Agar 10 g /L ?6-苄基腺嘌呤(6-BA):先 加少量0.1mol/L的NaOH和蒸 馏水稍加热使其溶解; ?萘乙酸(NAA):先用少量 95%乙醇和少量0.1mol/L的 NaOH溶解; 25 不同植物的最适pH值 种类 杜鹃 越桔 最适pH值 4.0 4.5 种类 月季 胡萝卜、 石刁柏 最适pH值 5.8 6.0 蚕豆 番茄 5.5 5.7 桃 7.0 26 预备阶段(2) ? 选择合适的外植体 ? 外植体大小要适宜; ? 外植体的部位影响其分化能力和器官分 化的类型; ? 外植体的年龄影响其分化率; ? 同一植物不同部位的分化需不同的生长 素/激动素比例; ? 不同物种的相同部位外植体分化能力不 一样; 27 预备阶段(3) ? 除菌 自来水多次漂洗 消毒剂处理 无菌水反复冲洗 外植体 无菌滤纸吸干 无菌外植体 切割 若干块无菌外植体置培养基上 28 常用消毒剂的使用和效果 消毒剂 次氯酸钠 次氯酸钙 漂白粉 升汞 酒精 过氧化氢 溴水 硝酸银 抗生素 使用浓度/% 2 9~10 饱和溶液 0.1~1 70~75 10~12 1~2 1 4~50 mg/L 清除 消毒时间/min 灭菌效果 容易 5~30 很好 容易 5~30 很好 容易 5~30 很好 较难 2~10 最好 容易 0.2~2 好 最容易 5~15 好 容易 2~10 很好 较难 5~30 好 中等 30~60 较好 29 植物不同器官的消毒和处理 ? 种子 纯酒精浸10 min,无菌水洗净,次氯酸钙(10%)浸 20~30 min,无菌水洗3~5次,无菌滤纸吸干; ; ? 果实 纯酒精迅速漂洗,次氯酸钠(2%)浸10 min,无菌水 反复冲洗,剥除种子和内部组织; ? 茎切段 自来水洗净,纯酒精漂洗,次氯酸钠(2%)浸15~20 min,无菌水洗3次,无菌滤纸吸干; ? 叶片 自来水洗净,纯酒精漂洗,升汞(0.1%)浸1min,或 次氯酸钠(2%)浸15~20min,无菌水反复冲洗,无 菌滤纸吸干; 30 诱导去分化形成愈伤组织 ?添加较高浓度的生长素; ?固体培养; ?液体培养; ?光照培养; ?黑暗培养; 31 形成愈伤组织所需的激素 ? 只需生长素类激素,如菊芋的块茎; ? 只需细胞分裂素激素,如芜菁根; ? 需上述两类激素,但有不同比例,多 数植物; ? 还需复杂的天然提取物(椰子乳)等; 32 生长素类激素 ? 吲哚乙酸(IAA),常用1~10mg/L; ? 吲哚丁酸(IBA),常用1~5 mg/L; ? 2,4-D( 2,4-二氯苯氧乙酸),常 用10-5~10-7 mol/L; ? 萘乙酸(NAA),常用1.0 mg/L; 33 细胞分裂素类激素 ? 激动素(KT) ? 6-苄氨基嘌呤(6-BA) ? 玉米素 先加少量 碱液预溶 34 继代增殖阶段 ? 移植扩增; ? 分割继代; 35 光照培养室 36 生根长芽阶段 ? 生长素与细胞分裂素对于细胞生长与分 化具有协同作用,它们的量以及比例的 不同配合,对细胞分化起着重要的作用; ? 外植体本身内源激素水平的差异,导致 它们分化时对培养基中所添加的这两种 激素量及其比例反应不尽相同; 37 长芽生根阶段 38 移栽成活阶段 ? 保湿是关键; ? 避免强光直射; ? 温度适宜; 39 植物组培的优缺点 ? 优点: A ?B ?C ?D ? 缺点

?A ?B ?C ? 40 手指玫瑰 41 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 本方法的历史、现状 ? ? ? ? ? ? 1956年,Routier & Nickell首先提出把植物细胞 当作工业合成天然产物的途径; 1968年,Reinhard, Corduan & Volks经培养生 产出“哈尔碱”(harmine); 1972年,Furuya & Ishii经培养生产出“维斯纳 精”(Visnagin); 1981年,Fujita等经培养生产出“紫草素”; 1991年,我国培养红豆杉细胞生产“紫杉醇”, 达到60mg/L; 目前世界最大的细胞培养罐达20 t; 42 红豆杉合成的紫杉醇是著名的抗癌药物 43 细胞培养和原植物的天然产物量的比较 物 种 天然产物 产 细胞培养 量 原 植 物 橘叶鸡眼藤 蒽醌 决 明 蒽醌 长 春 花 蛇根碱 三角叶薯蓣 薯蓣皂苷 人 参 人参皂角苷 烟 草 烟碱 烟 草 泛醌 大 红 罂 粟 蒂巴因 900微克/克干重 鲜重的0.334% 干重的1.3% 26mg/克干重 鲜重的0.38% 干重的3.4% 0.5mg/克干重 130mg/克干重 110微克/克干重 种子干重的0.21% 干重的0.26 % 20mg/克干块根 鲜重的0.3~3.3% 干重的2~5% 16mg/克干叶 140mg/克干叶 44 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 从植物培养细胞中获得的各类物质 氨基酸 核酸 蛋白质 碳水化合物 脂类 维生素 有机酸 抗白血病药 抗肿瘤药 抗病毒药 抗微生物药 酶 抑制剂 色素 香料 甜味剂 鸦片 杀虫剂 激素 强心苷 核苷酸 橡胶 阿司匹林 奎宁 可卡因 45 培养植物细胞制造疫苗 ? 2006年2月,美国Dow AgroSciences公司 完成了世界上第一个注册的植物制造疫 苗; ? 将病原菌抗原决定基因转入植物基因组 中,利用植物细胞而不是整株植物在一 个安全的室内环境中生产疫苗,以激活 人体的免疫能力。在制造过程中完全不 含有任何动物成份。 46 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 悬浮培养 1.成批培养(封闭式培养) 优点:易于操作; 次生代谢物含量高; 缺点:效率低; 2.半连续和连续培养 47 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 固定化细胞培养 次生代谢物的积累和细胞分化具有正相关性; 细胞固定化有利于组织化的形成; ? 细胞固定化有利于在细胞团间和细胞团内形成 化学物质和各种物理因素的梯度,这是高产次 生代谢物的关键; ? 细胞固定化有利于对外环境参数进行调控; ? 细胞固定化有利于回收次生代谢物; ? 48 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 平床培养系统 优点:制作简单; 能生产较多次生代谢物; 缺点:占地面积大; 分化区比例较小; 02供应受限; 49 包埋法固定细胞 将细胞包埋在凝胶载体的微小空格内或包 埋于半透性聚合物的超滤膜内,它又分为凝胶 包埋法和微胶囊法。

⑴凝胶包埋法固定化(gel immobilization) ①海藻酸盐(alginate) ⑴β-角叉胶(β-carrageenan) ⑵琼脂糖(agarose) ⑶琼脂(agar) ⑷聚丙烯酰胺(polyacrylamide) ⑸壳聚糖(chitosan) ⑹白明胶(gelatin) 50 微胶囊法 微胶囊法是利用天然的或合成的高 分子材料作为微囊壁材,包裹成微小球 囊,培养基成分和代谢产物等小分子物 质可以通过,细胞不能通过,使囊内成 为一个微小环境。 51 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 立柱培养系统 1.细胞固定化 ? 琼脂固定细胞 52 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 褐藻酸钙固定细胞 等量混合→ 注入尼龙网→ 无菌大量培养植物细胞 配制4%褐藻酸钠,灭菌 氯化钙溶液(2%)浸浴 褐藻酸钙固定的细胞团 53 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 立柱培养系统 优点:占地面积小 次生代谢物产量高 缺点:制作较复杂 O2供应受限 54 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 立柱培养系统操作要素: ? ? ? ? 取静止期细胞,并使细胞达到一定密度; 控制营养液的成分(包括激素)、浓度及O2供 应; 某些种的细胞培养需光照; 尽可能选择次生代谢物能自然或诱导后从细胞 内释出的植物(品种); 55 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 提高次生代谢物产量的途径 ? 生物种性

1.选择高产的品系或细胞系; 目测法,化学分析法,外因选择法; 2.诱变筛选高产细胞系

化学法,物理法; 3.通过细胞融合或基因工程创造高产细胞系; 56 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 提高次生代谢物产量的途径 ? 培养条件: 1.培养基: A 碳源:常用蔗糖,但应因种摸索; B 氮源:常用NO3-和NH4+,(或单用或兼 用); C 生长调节剂:生长素及细胞分类素。两者 的比例对细胞生长、分化及次生代谢物生 产具极大影响; D 供给目的产物的直接或近直接前体物质; 57 第二节 植物细胞培养和次生代谢物生产 ? 提高次生代谢物产量的途径 ? 培养条件: 2.物理因子

A 光质和光量(适量光照); B 温度:25~30℃; C 通气:底部通气好; D pH值:5~6 58 第三节 植物原生质体制备与融合 几个名词: ? 原生质体(protoplast):去除全部细胞壁的细胞; ? 亚原生质体(subprotoplast):只含有部分原生 质的原生质体(有核或无核); ? 微原生质体(miniprotoplast):经细胞松弛素B 处理得到的仅含少量胞质及核或染色体的小原 生质体; ? 原生质球(球状体,spheroplast):残存少量细 胞壁的原生质体; 59 植物原生质体研究的意义 ? 有利于进行远缘杂交; ? 有利于引入生物大分子、细胞器等; ? 有利于进行细胞操作(核、叶绿体等); 60 植物原生质体的制备(1) ? 机械法: 高渗处理 植物(外植体,愈伤组织,液培细胞) 机械切割 质壁分离 原生质体(亚原生质体) 缺点:难,少,分生组织不宜; 61 植物原生质体的制备(2) ? 酶解法 1.酶的购置与纯化 市售的纤维素酶一般都是复合酶,含

纤维素酶C1; 纤维素酶Cx; 纤维二糖酶; 果胶酶; 磷脂酶; 核酸酶; 过氧化物酶; 酚类; 此外,还有蜗牛酶; 最好应纯化 62 植物原生质体的制备(3) ? 酶解法 2.取材:干净,高活性 A 幼嫩的根、茎、叶; B 悬浮培养的细胞和体细胞胚; 无需灭菌,最好同步化; C 花粉母细胞和四分体; 分生能力强,应使用蜗牛酶; 63 植物原生质体的制备(4) ? 外植体除菌: 外植体 肥皂水洗 清水洗 酒精 (75%,10s) 无菌水洗3~4次 次氯酸钠(3%,15min) 无菌滤纸吸干 64 植物原生质体的制备(5) ? 外植体酶解 除菌后叶片 撕去下表皮 25~30℃ 切块放入反应液 不时轻摇 2~4 h 反应液转绿 65 植物原生质体的制备(6) ? 外植体酶解 ?缓冲液:pH值 5.5~5.8 ?渗透压稳定剂:糖、甘露醇、山梨醇等 ?膜保护剂:钙盐、牛血清蛋白、葡萄糖 硫酸钾(0.3%) ?表面活性剂:Tween 80 ?适当时间 ?适当温度 66 植物原生质体的制备(7) ? 原生质体分离 ? 过滤法 ? 离心法(低速) ? 漂浮法(不同比重) 67 植物原生质体的制备(8) ? 原生质体洗涤 以新的渗透压稳定剂或培养 液轻轻洗涤2~4次; 68 植物原生质体的制备(9) ? 原生质体鉴定 1.直接镜检

球形,低渗破裂,荧光增白剂(UV下细胞壁 显绿色荧光) 2.活力测定

? 双醋酸荧光素(FDA)染色法:FDA进入细胞, 被脂酶分解产生有荧光的极性荧光素;FDA不能 进入死细胞; ? 台盼蓝染色:台盼蓝不能进入活细胞; ? 胞质环流观察; 69 植物原生质体的培养基 V-KM培养基(mg/L) ? 无机成分: KNO3 725; CaCl2· 2O 685; MgSO4 560; NH4NO3 288; K2HPO4 68; Na2· 2H EDTA 37.3; Fe2SO4· 2O 27.8; H3BO4 3.0; 7H MnSO4· 2O 10.0; 4H ZnSO4· 2O 2.0; 7H KI 0.75; Na2MoO4· 2O 0.25; CoCl2· 2O 0.025; CuSO4· 2O 0.025 2H 6H 5H ? 糖类

(mg/L) 葡萄糖 68000; 蔗 糖 250; 果 糖 250; 核 糖 250; 木糖 250; 甘露糖 250; 甘露醇 250; 鼠李糖 250; 山梨醇 250; 纤维二糖 250; ? 维生素: (mg/L) 维生素C 2.0; 维生素B1 1.0;维生素B6 1.0;氢化胆碱 1.0;对氨基苯甲酸 0.02; 叶酸 0.4; 生物素 0.01; 维生素A 0.01; 维生素D3 0.01;维生素B12 0.01; ? 生长调节物: 酪蛋白 250;肌醇 100;椰子汁 20ml; NAA 1.0; 6BA 0.5; 2,4-D 0.2; ? 有机酸: 柠檬酸 40;苹果酸 40;反丁烯二酸 20;丙酮酸钠 20; 70 植物原生质体再生培养方法(1) ? 固体平皿培养法 原生质体悬液2ml 小培养皿 MS培养基配制的1.2% agar 2ml 置大皿内(预加湿滤纸) 100~300lux,12h?d-1) 摇匀 冷却 (25~28℃, 腊带封口 培养 分化培养基 愈伤组织 成苗 71 植物原生质体再生培养方法(1) ? 固体平皿培养法 优点:便于定点观察 原生质体不易破裂 缺点:通气较差 原生质体与琼脂混合不易掌握 原生质体过于分散 72 植物原生质体再生培养方法(2) ? 液体培养法 原生质体置液体培养基中培养,不时 轻摇,能较快生长。细胞团形成后应移 到固体培养基中才能继续生长或诱导分 化成苗。 缺点:原生质体易受损 通气较差 操作较麻烦 73 植物原生质体再生培养方法(3) ? 液体浅层培养法(液-固法) 营养琼脂培养基(0.6%) 放置无菌滤纸 小皿凝固 注入3mL原生质体悬浮液 封口 愈伤组织 保温,光照 分化培 放大皿内(垫湿滤纸) (或不光照) 轻摇 养基 成苗 74 植物原生质体再生培养方法(3) ? 液体浅层培养法(液-固法) 优点:通气好 营养均匀 生长较快 缺点:需定期添加培养基 不易更换培养基 75 植物原生质体再生培养方法(4) ? 小块液培法 原生质体悬浮液 琼脂糖(0.8%) 切小块 混匀 倒平皿凝固 80~100rpm, 置液体培养基中 25~28℃ 成苗 愈伤组织 移放分化培养基 76 植物原生质体再生培养方法(4) ? 小块液培法 优点

缺点: 77 植物原生质体再生培养方法(5) ? 固体活性炭培养基 琼脂培养基+1%活性炭 原生质体悬浮液 平皿培养 优点

成苗 混匀 凝固 缺点: 78 植物原生质体再生培养方法(6) ? 混合培养(液体或固体培养基) 将两种原生质体混合培养 有何意义? 79 植物原生质体融合回顾 ? 1909 Kuster 把洋葱根放在浓硝酸钙溶液中,见质壁分离的亚原生质体, 复原时观察到亚原生质体的融合; ? 1931 Plower用针插入原生质体,使质膜和液泡膜融合; ? 1937 Michels观察到同种和不同种原生质体的融合; ? 1960 Cocking用真菌纤维素酶获得大量番茄根的原生质体; ? 1970 Power用NaNO3使燕麦和玉米的原生质体融合; ? 1971 Takete首次将烟草原生质体再生成完整的植株; ? 1972 Carlson首次经原生质体融合获得种间杂种烟草; ? 1973 Keller提出高pH高钙法诱导原生质体融合; ? ? ? ? ? 1974 Kao提出聚乙二醇法诱导原生质体融合; 1977 Kao把高pH高钙法与聚乙二醇法相结合; 1978 Melchers获得属间杂种(番茄 ╳ 马铃薯); 1979 Senda提出电激法融合原生质体; 1987 斯维格将电融合与微培养结合; 80 植物原生质体融合(1) ? 化学法诱导融合 (无菌操作) ? ? ? 按一定比例混合双亲原生质体悬液; 吸一份混合液于表面皿上,静置10min; 滴加3份聚乙二醇(PEG)溶液,轻轻摇匀; PEG溶液组成

PEG 50%(MW=1560~6000) glucose 0.1mol/L CaCl2 10.5 mmol /L KH2PO4 0.7 mmol /L pH 5.5 81 植物原生质体融合(2) ? 化学法诱导融合(续前) ? ? ? ? ? ? 25℃保温15~45min,不时轻摇; 滴加1份高钙高pH溶液稀释,摇匀; 高钙高pH溶液组成

glycine 50 mmol /L CaCl2 50 mmol /L glucose 300 mmol /L pH 10.5 10~15min后,再滴加1份高钙高pH溶液稀释,摇匀; 10~15min后,再加1~2mL原生质体培养液,摇匀; 用20mL原生质体培养液洗5次,间隔5min; 加0.5mL原生质体培养液,微滴培养; 82 植物原生质体融合(3) ? 物理法诱导融合 ? ? 微电极法 两个微电极尖端分别与两个靠近的原生质 体表面接触,用5~12 μA的电流刺激1~5毫秒, 促成融合。

平行电极法 相距200 μm的微电极插入原生质体溶液中, 先通入交变电场,使其紧密接触成串珠状;再 施以适当电脉冲,原生质体接触区发生可逆击 穿而融合; 83 植物原生质体融合(4) ? 不对等细胞融合(灭活一方原生质体) 84 原生质体融合后的产物 1. 亲和杂种细胞(难) 2. 部分亲和的杂种细胞 含双方胞质及一方核 含双方胞质及一方核和少量它方染色体 (细胞周期短或继代次数少的一方,染色体易保留) 3. 异核质杂种(少) 4. 嵌合植株 85 融和体的鉴别 ? 细胞鉴别 细胞大小 色素有无 细胞核大小 荧光鉴别 ? 植株鉴别 形态特征 染色体显带 同功酶法、过氧化物酶法 分子杂交法 RFLP法 RAPD法 86 杂种细胞筛选 ? 显微操作法 要有:可识别标志 显微操作仪 能培养单个原生质体的培养基 ? 遗传互补法 要有具突变标记的品种 1. 白化互补法 2. 生长互补法 3. 抗性互补法 4. 代谢互补法 87 西红柿与马铃薯杂交研究进展 ? ? ? ? 1971年,Power提出设想 1978年,Melchers用原生质体融合法获得9株杂种株 1983年,Shepard亦融合成功 亟待解决的问题: 1. 哪些基因和条件决定果实与块茎的形成 2. 光合作用产物的运输方向与分配 3. 光合作用产物是否足以供应地上和地下部分的生长、发育需要 ? 1994年,Schoenmakers继续本研究 ? 1995年,Wolters还在研究 88 第四节 单倍体植物的诱发与利用 一.单倍体植物的特点

? 株矮,叶、花、果小,生活力弱; ? 高度不育; ? ? 89 第四节 单倍体植物的诱发与利用(2) 二.单倍体植物的利用

? 可加快培育新品种; ? 有利于突变体的选择与利用; ? ? 90 第四节 单倍体植物的诱发与利用(3) 三.诱导产生单倍体植株的途径: (一)自然发生 1.孤雌生殖 2.孤雄生殖 3.无融合生殖 91 第四节 单倍体植物的诱发与利用(4) 三.诱导产生单倍体植株的途径: (二)人工诱导

1.花药培养

1.1选取成熟度适中的花蕾或幼穗 ; 1.2花药预处理 ; 1.3选择适当的培养基与培养条件: 1.3.1 只需简单培养基; 1.3.2 培养基尚需添加激素; 1.3.3 培养基添加脯氨酸、羟脯氨酸、谷氨酰胺; 92 第四节 单倍体植物的诱发与利用(5) 1.4 培养条件: 降低气压; 纯N2密闭处理30~60min,或掺入O2 2.5~5.0%; 0.5mol/L甘露醇处理2天; 花药平放; 适当密植; 93 第四节 单倍体植物的诱发与利用(6) 1.5 花药单倍体植株的形成途径: 1.5.1 生殖细胞退化,由营养细胞分裂产生;(常见) 1.5.2 小孢子细胞不分化成营养细胞和生殖细胞, 直接分裂、分化长成;(常见) 1.5.3 营养细胞和生殖细胞都参与愈伤组织和胚 的形成; 1.5.4 仅由生殖细胞分裂形成; 94 第四节 单倍体植物的诱发与利用(7) 2. 离体花粉培养 挤压法分离花粉; ? 自然散开法分离花粉; ? 3.未授粉子房或胚珠的培养 4.杂交法获单倍体植株 95 第四节 单倍体植物的诱发与利用(8) 5.单倍体植物的加倍 用秋水仙素(0.2~0.4%)处理24~48h; 加倍方式? 96 Section 5. Researches on Artificial Seeds 人工种子的研制(1) 人工种子:含有植物胚状体或芽、营养成 分、激素以及其它成分的人工胶囊; 人工种子的构成

? 胚状体:由组织培养或细胞培养产生; ? 人工胚乳:营养物质+激素+农药+抗生素 + 除草剂等; ? 人工种皮:抗压,保水,透气; 97 Section 5. Researches on Artificial Seeds (2) ?Characters of artificial seeds: ?不受环境因素制约, 一年四季进行工厂 化生产; ?有利于保存该种系的优良性状; ?成本低,适合于机械化播种; ?可添加营养物、激素、农药、抗生素、 除草剂等,以利胚状体的健康生长。 98 Section 5. Researches on Artificial Seeds (3) The synchronous growth of embryoid 胚状体的同步化生长: 低温法 ? 抑制剂法 ? 分离法:分离胚性细胞团; ? 通气法:通入N2或乙烯; ? 渗透压法 ? ? ? 99 Section 5. Researches on Artificial Seeds (4) ? Preparation for artificial endosperm 人工胚乳的制备: MS培养基 + 淀粉水解物 + 激素 +抗生素 + 农药 + 除草剂 等; Any one else? 100 Section 5. Researches on Artificial Seeds(5) ? Embedment of artificial seeds 人工种子的包埋(滴注法) 胚状体 褐藻酸钠(终浓4%) 混匀 CaCl2(2.0~2.5 %)圆形 胶囊 10~15min 合成胚乳 无菌水漂洗 捞起 Elvax4260处理干燥 圆形人工种子 还有其他方法? 101 Section 5. Researches on Artificial Seeds(6) ? 人工种子的直径由 决定; ? 人工种子内含胚状体数目取决于 ; ? 人工种皮的厚度因 而定; 102 Section 5. Researches on Artificial Seeds(7) ? 人工种子的干燥: ? 自然干燥 ? 人工干燥:22 ± 2℃, 相对湿度70± 5% 4~6 d ; 胚状体由玻璃状转为不透明表示发育成熟。 干燥的目的? 103 第六节 植物脱病毒技术(1) ? 病毒对植物的危害 ? 植物哪些部位可能没病毒或较少病毒? ? 植物哪些器官或部位无维管束(或维管束不发 达)? ? 切割外植体时是大些还是小些比较可能获得无 毒组织块? ? 组织块大些还是小些比较容易获得愈伤组织? 104 第六节 植物脱病毒技术(2) ? ? ? ? ? ? 脱除不同病毒时所取的茎尖大小一样吗? 茎尖很小,实验时应注意哪些问题? 为什么有人喜欢用花瓣来脱病毒? 哪些外因能被用于脱除病毒? 通过培养愈伤组织能脱毒吗?Why? 哪些途径可使脱毒植株不再染毒? 105 第六节 植物脱病毒技术(3) 茎尖脱毒 1. 茎尖培养

茎尖越小越没病毒,但越小越难成 活,一般要超过2万个细胞,或至少3~10 mg茎尖。

2. 花瓣培养 3. 花药培养 106 植物脱毒检测(4) ?电镜法 ?免疫血清法 离心 去渣 植物组织匀浆 动物免疫 免疫检测 上清液 纯化病毒 待检植物匀浆上清液 抗血清(抗体) 107 植物脱病毒进展(5) ? 脱毒马铃薯(青海) 染有病毒的普通马铃薯亩产约1吨,脱病毒的 马铃薯亩产达4吨;全国年种马铃薯3400万公顷; ? 脱毒草莓 红宝石色,酸甜适口,果汁丰润,果香四溢; ? 脱毒唐菖蒲 ? 长势旺盛,花色艳丽,品质提高1~2个等级; 脱毒水仙 108 Chapter 3. Animal Cell Engineering 第三章 动物细胞工程 ?The o main content: o o o o 动物细胞与组织培养; 动物细胞融合; 动物细胞核移植与胚胎克隆; 淋巴细胞杂交瘤与单克隆抗体; 染色体转移与基因转移; 109 Section 1.Cultivation of Animal Cells and Tissues 第一节 动物细胞与组织培养 ? 细胞培养:细胞在体外条件下的保存和生长, 在培养过程中不形成组织; ? 组织培养:组织在体外条件下的保存和生长, 继续保持组织的结构和功能; ? 器官培养:器官的胚芽、整个器官或器官的 一部分在体外条件下的保存和生长,可有器官 的分化,并保持器官的立体结构和功能; 110 细胞系? (Cell line) 原代培养物经首次 传代成功后的细胞培养物,包括:有 限细胞系和连续细胞系; 细胞株? (Cell strain) 通过选择或克 隆从原代培养物或细胞系中获得的具 有特定性质或标志的培养物; 111 Section 1. Cultivation of animal cells and tissues 第一节 动物细胞组织培养 一.细胞培养 制备动物细胞: 培养液漂洗 切割 解离液 无菌取出目的组织 细胞 离心洗涤 抗生素漂洗 无菌组织 小组织块 移放培养瓶 112 动 物 细 胞 培 养 113 Quantitative cultivation of mammal cells 二. 大量培养哺乳动物细胞 ? 微导管法 以醋酸纤维素或硝酸纤维素构成空心纤维 管,搭成多层培养床。管内通空气,管外为培 养液; ? 微载体法 葡萄糖等聚合物形成直径50~500μm的微球 悬浮培养液中 细胞贴附生长 ? 微胶囊法 细胞与褐藻酸钠混合液 滴入CaCl2中 褐藻酸钙胶囊 悬浮培养 114 动物细胞 培养器 115 Tissues cultivation 三. 组织培养 动物表面消毒 解剖 获组织 无菌刀切 培养液、抗生素漂洗 小组织块 加培养液 吸放培养瓶 静置培养(37℃) 众多组织块 传代 组织块长大 鸡胚心肌组织如何培养? 116 Generation of the cultivated cell 四. 培养细胞的传代 胰酶· EDTA 离心 培养细胞 弃上清 贴壁细胞游离 加新培养液 分瓶 细胞沉淀 悬浮细胞 培养 117 Non-serum cultivation 五. 无血清培养 ? 血清培养的缺点: ? 无血清培养基的组成: 成分不确定,批次有差异,容易受污染,价格较昂贵; ? 基础培养基:常用DME与F12培养基等量混合; ? 基质:纤粘素,血清铺展因子,胎球蛋白,多聚赖 氨酸,胶原; ? 生长因子、维生素和激素等约30余种微量有机和无 机物; 118 六.无血清培养基常用生长因子与激素 胰高血糖素 神经生长因子 胰岛素 甲状腺释放激素 前列腺素E2a 表皮生长因子 成纤维细胞生长因子 前列腺素E1 生长激素 黄体化激素释放激素 黄体化激素 甲状旁腺激素 转铁蛋白母羊因子 氢化考的松 Sometomedin C 无脂肪酸牛血清白蛋白 雌二醇 孕酮 促卵泡刺激因子 睾酮三碘甲状腺氨酸 亚油酸 维生素A醇 ?-生育酚 维生素C 腐胺 CdSO4 H2SeO3 119 Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (1) ? 微生物污染: o o o o ? 其它细胞污染; 120 细菌污染; 真菌污染; 支原体污染; 病毒污染 Keep free from biological contamination ?污染来源: ? 人员操作; ? 血清; 七. 防治污染 (2) ? 不洁动物标本; ? 空气:操作室与超净台的过滤设备老化; ? 器械灭菌不彻底; 121 Keep free from biological contamination 七. 防治污染 (3) ? 污染物鉴别: ?肉眼观察; ?光学显微镜观察; ?电子显微镜观察; ?特殊培养观察:支原体 122 Keep free from biological contamination 七. 防治污染 污染源 细 菌 真 菌 支原体 病 毒 其它细胞 治 理 青霉素(200u· -1),链霉素(200? · -1) mL g mL 制霉菌素(100u · -1) mL 卡那霉素(100 ? · -1,不能根除) g mL ? 1.同一工作面不能有其它细胞系存在; 2.两种细胞系不能共用培养器具; 123 Long-term conservation of cell culture 八. 细胞培养物的长期保存 ?传代法:Carrel使鸡胚心细胞传3400次, 34年; ?液氮法: 混匀 培养细胞 细胞/安瓿 甘油/二甲亚砜(5~10%) 安瓿封装 降温至-30 ℃ (1~3 ℃/min ) 降温至-150 ℃ (15~30 ℃/min ) 置液氮(-196 ℃)中 低温保存细胞 124 Anabiosis of Cell 细胞复苏 取出安瓿,投入37 ℃ 水浴,轻摇, 重新形成细胞悬液 (注意防护) 125 Section 2 Fusion of Animal Cells 第二节 动物细胞融合 ? 1958年,日本冈田善雄意外发现经UV灭活的仙 台病毒可诱发艾氏腹水瘤细胞相互融合; ? 1960年,法国Barski发现两种不同类型细胞混 合培养会自发形成融合细胞; ? 1965年,冈田善雄等采用灭活的仙台病毒融合 产生第一个动物种间异核体; ? 1966年,Yerganian用相同的方法获得能增殖 的杂种细胞; 126 Animal Cell Fusion Induced by Virus 病毒诱导融合 分别制悬液 混合离心 双亲本细胞 细胞沉淀 细胞凝集 灭活仙台病毒(疱疹病毒,副黏液病毒) 混匀,冰浴20min,稍摇 37 ℃ 30 min 各种融合子 洗涤 选择培养基 所需的融合子 127 Cell Fusion Induced by Chemicals 化学诱导融合 ? 1974年,高国南发现PEG能诱导植物细胞原 生质体融合; ? 1975年,Pontecorvo用PEG法融合动物细胞 成功; o 悬浮法 PEG4000 40~50%,处理1~2 min; o 离心法 PEG1000 30~40%,离心5~8 min; (可加5~15% 二甲亚砜) 128 电激诱导融合 与植物原生质体相同 129 Screening Hybrid Cells 杂种细胞筛选 ? 抗药筛选 ? 营养缺陷筛选 130 Application of Cell Fusion 细胞融合的应用 ?基因定位; ?体细胞杂种致瘤性分析; ?遗传缺陷的基因互补研究; ?分化功能表达调控; 131 Section 3 Monoclonal antibody produced by lymphocyte hybridoma 第三节 淋巴细胞杂交瘤产生单克隆抗体 抗原 记忆细胞 B淋巴细胞 产生 (脾)浆细胞 筛选 特异抗体 融和 小鼠骨髓瘤细胞 杂交瘤细胞 产生 特异抗体 2002年12月神舟4号飞船搭载B淋巴细胞和骨髓 132 瘤细胞升空进行细胞融合实验 单 克淋 隆巴 抗细 体胞 技杂 术交 示瘤 意产 图生 133 Screen of hybridoma 杂交瘤细胞的筛选(1) ? HGPRT基因缺陷的肿瘤细胞不能在含HAT 的选择培养基上生长; ? B淋巴细胞具有HGPRT基因但不能在体外 生长。

? 利用这两种细胞各自的特点,筛选能在 体外含HAT的培养基中生长的融合子。 HGPRT

次黄嘌呤核糖磷酸转移酶 HAT

次黄嘌呤,氨基喋呤,胸腺嘧啶 134 Screen of hybridoma 杂交瘤细胞的筛选(2) ? ? ? ? 如何获得融和细胞? 如何得到单个融和细胞? 鉴别是否分泌所需抗体; 融和细胞的遗传稳定性; 135 Section 4 Cell Reconstruction & Animal Clone 第四节 细胞重构与动物克隆 将细胞的各部件进行重 新组合装配,主要有核移植、 叶绿体移植、核糖体重建及 线粒体装配等技术。 136 Technique for Animal Clone 动物克隆技术 一. 细胞核移植 1. 细胞核的制备: 1) 显微操作法 2) 细胞松弛素B处理法 细胞培养 细胞松弛素B处理 获得核质体和胞质体 如何分离? 137 离心 2. 童第周、牛满江等的鱼类 移核研究 ? 鲤鱼囊胚期胚胎的细胞核 鲫鱼去核受精卵 核移植 杂合细胞 部分细胞分裂 发育 成鱼 (口须和咽区象鲤鱼,脊椎骨数象鲫鱼,侧线鳞 片数为中间类型,血清与血红蛋白电泳证明确 为杂种鱼。) 138 ?草鱼与团头鲂(亚种间) 子代像草鱼,雄性不育 ?金鱼与鰟鲏鱼(亚种间) 获中间性状杂种鱼 139 牛满江教授在海南大学作学术演讲 2005年10月31日,美籍华人牛满江教授来海南大学为该校师生们作了精 彩的学术演讲。

当天还是牛满江教授93岁大寿。牛满江教授祖籍河北博野, 1936年毕业于北京大学生物系。1953年起,发表有关核酸(RNA)诱导功能 论文,引起生物学界的重视,成功地创立了“外基因学说”。

140 科学家发现细胞质影响克隆鱼发育新证据 ? 中科院水生所朱作言院士发表在2005年3月美国《繁殖 生物学》上的文章“细胞质对来源于转基因鲤鱼的细胞 核与金鱼去核卵配合的属间克隆鱼发育的影响”报道

? 以转生长激素基因鲤鱼的胚胎细胞核为供体,以金鱼去 核未受精卵为受体,进行属间克隆,在总共501枚操作 卵中,得到7尾正常发育为成体鱼的属间克隆鱼。克隆 鱼的外形特征酷似细胞核供体鲤鱼而不同于受体金鱼, PCR检测和总DNA的RAPD比较分析均证实克隆鱼的核 基因组DNA来源于供体鲤鱼; ? 在血液循环期以前的克隆胚胎中共存着来源于供体和受 体两种类型的线粒体DNA,在其后续发育阶段的克隆胚 胎直至克隆鱼个体中,仅存在受体细胞质的线粒体DNA; 在7尾克隆鱼中,6尾个体的脊椎骨数量是26-28个,1尾 个体的脊椎骨数量是31个,而通常鲤的脊椎骨数量是 141 33~36个,金鱼的脊椎骨数量是26~28个。 Clone of mammalian 3. 哺乳动物克隆 ? 1952年,Briggs取出蛙中胚层细 胞的细胞核植入去核受精卵中, 未发育;但改用囊胚期细胞核获 得部分成功; ? 1964年,Gurdon将非洲爪蟾小肠 上皮细胞的细胞核取出,重复上 述实验,部分发育成蝌蚪; ? 1984年,维拉特森以未成熟胚胎 细胞克隆出一只活产羊; 142 ? 1994年,菲尔斯特用120个细胞的胚胎克 隆出牛; ? 1996年,维尔穆特用羊胚细胞克隆了羊; ? 1997年,维尔穆特用羊乳腺细胞克隆了 “多莉”羊; 143 Viable offspring derived from fetal and adult mammalian I. Wilmut et al. Nature, 1997, 27, Feb. 385(6619):810-813 Cell type No. of No. of No. of No. of No. of fused recovered morula or pregnancies live blastocysts / couplets from lamb transferred No. of oviduct recipients Mammary epithelium 277/434 (63.8%) 247 (89.2%) 29 (11.7%) 1/13 (7.7%) 1 (3.4%) 144 Birth of “Dolly” ? 1997年,维尔穆特用羊乳腺细胞克隆了多莉羊; 取434个绵羊乳腺细胞的细胞核与同等数量的去核 卵电激融合 277个融合细胞(63.8%) 移入母羊输卵管发育,成功247个(89.2%) 发育到桑葚胚29个(11.7%) 只母羊子宫 分别植入13 仅生一只“多莉”(0.23%) 145 “多莉(Dolly)”的身世 1.从芬兰多塞特母绵羊的乳腺中取出乳腺细胞,将其放入 低浓度的营养培养液中,细胞逐渐停止了分裂,此细 胞称之为供体细胞; 2. 从一头苏格兰黑面母绵羊的卵巢中取出未受精的卵细 胞,并立即将其细胞核除去,留下一个无核的卵细胞, 此细胞称之为受体细胞; 3. 利用电脉冲的方法,使供体细胞和受体细胞发生融合, 最后形成了融合细胞,由于电脉冲还可以产生类似于 自然受精过程中的一系列反应,使融合细胞也能象受 精卵一样进行细胞分裂、分化,从而形成胚胎细胞; 进行早期胚胎发育; 4. 将早期胚胎转移到苏格兰黑面母绵羊的子宫内,胚胎 细胞进一步分化和发育,最后形成一只小绵羊。 146 147 1997年2月27日,《Nature》封面,“多莉”(Dolly)克隆 148 羊 Basic pathway for cloning mammalian 克隆哺乳动物基本途径 取出体细胞核 未受精卵去核 体外发育 易核卵 早期胚胎 化学或电激诱导融合 植入代孕母畜子宫中 假孕状态 产下幼畜 149 3. 哺乳动物克隆 ? 1998年后,日、美、新西兰和中国等用体细胞 核克隆出鼠、牛、猪、猴、羊等哺乳动物。

? 2003年5月4日,美国克隆出一只骡。

? 2003年8月6日意大利科学家宣布以自体克隆的 方式克隆出一只小母马;小母马的“妈妈”也 是其“姐姐”,也是“自己”。

? 2003年9月,巴西科学家用意外死亡奶牛的卵 泡中的颗粒细胞克隆出正常奶牛; ? 2003年10月我国山东莱阳农学院克隆牛“双双” 经人工授精,产下“健健”,证明克隆牛具正 常生殖能力; 150 自体克隆的小母马Prometea 151 美国马萨诸塞州的生物技术公司Advanced Cell Technology 2001.11.25成功克隆出人类胚胎,在克隆人的技术上迈出了重 要一步,不过该公司表示其目的不是为了克隆人,而是为了获 得能够用于治疗帕金森综合症和青少年糖尿病等各种疾病的干 细胞。

152 2002年 内蒙古大学郭继彤等用成年耳细胞克隆山羊 153 我国首例异种克隆北山羊诞生 ? 2004年1月21日在新疆乌鲁木齐县六十户乡降 生中国首例异种克隆动物———克隆北山羊。

? 将北山羊的体细胞与山羊的卵母细胞结合组成 新的胚胎,待胚胎发育到一定阶段移植到发情 的母山羊体内。克隆北山羊,雌性,出生重为 2.32公斤,体长42厘米,体高35厘米。

? 在异种克隆研究领域,目前国际上仅有印度野 牛和欧洲 盘羊取得成功。 154 2004年2月15日,美国爱达荷大学的研究人员在西雅图 的美国科学年会上展示三头克隆骡子。科学家们从骡子胚胎 细胞核内提取细胞核,然后用移植手段将其与去核的马卵细 胞结合形成卵母细胞。科学家们共进行了305次尝试,结果 155 只有3个克隆骡子胚胎存活。 Heterogeneity cloning of panda 异种克隆大熊猫 ? 中科院陈大元研究员提出 ? 如何实施? ? 目前进展 156 世界首例成年体细胞克隆水牛2005年3月17日在 广西大学“863计划”良种牛南方繁殖中心诞 生 这头克隆水牛的顺利出生,是国家“863计划”、 “生物反应器”重大研究专项的一项标志性成果, 中国的水牛体细胞克隆技术已经初步成熟。

157 2005年4月24日韩国科学家培育出首 只克隆狗 “史纳比(snuppy )” 汉城大学教授黄禹锡(中) 158 这次研究制造的1095个胚胎只有三个成功受孕, 其中一个流产,另一只小狗出生22天后因肺炎死 亡,只有史纳比(snuppy )仍然生存,成功率 只有0.09% 159 我国第一头体细胞克隆猪诞生 经中国农业大学李宁教授领导的课题组一年多的 科技攻关,2005年8月5日,我国第一头体细胞克 160 隆猪终于在河北省三河成功诞生。 意大利克隆成功14头仔猪 2005年10月29日,意大利克雷莫纳繁殖技术 研究中心一次性成功地克隆出了14只小猪仔 161 国际首例体细胞克隆亚洲黄羊临沂降生 2005年12月8日中国科学院动物研究所用山羊克隆的一 只亚洲黄羊(左)与普通山羊一起在山东临沂亮相。 162 克隆猛犸象? ?猛犸象已经消失3000多年; ?没有被破坏的猛犸象细胞 ; ?猛犸象精液 ; 163 Worry about mammalian cloning 哺乳动物克隆的忧虑 ? 流产率高; ? 难产率高; ? 畸形率高; ? 围产期死亡率高; ? 幼年死亡率高; 164 Personal Clone 克隆人 ? ? ? ? ? 克隆人做得到吗? 人的年龄会被克隆吗? 人的智力能被克隆吗? 克隆人的社会伦理问题; 世界各国普遍反对克隆人; 165 克隆技术应该应用于哪些领域 ——新浪网调查 1克隆濒临灭绝的动物 66.32% ; 2克隆人类部分器官用于医疗62.11%; 3克隆国家保护的动物 27.37%; 4创造新的物种 17.89%; 5克隆可食用的动物 11.58%; 6克隆人类用于生活 7.37%; 7其它 5.26% 166 坚持克隆人的3位科学家 意大利医生 安蒂诺里 Antinori 美国医生 扎沃斯 Zavos 邪教组织 “雷利安运 动”的法国 科学家 布瓦 瑟利耶 167 Brigitte Clone of human embryo 克隆人类胚胎 ? 英国政府2004年8月向纽卡斯尔大学颁发 了世界上第一份克隆人类胚胎的合法执 照,批准这所大学进行以医疗为目的的 克隆人类胚胎研究。 168 Section 5 Chromosome Transfer 第五节 染色体转移 ? 微细胞(微核体)介导 微细胞(minicell):只含有一至几条染色体、 少量细胞质和完整质膜的核质体。

优点: A. 简化供体; B. 受体细胞受影响小; C. 染色体很少损坏或不损坏; 169 Preparation for minicells 微细胞制备 秋水仙素0.1? g/mL,8~16h 细胞松弛素B 1 ? g/mL,4~6h 供体细胞培养 12000g,10min 中期细胞 细胞松弛素B 10 ? g/mL,0.5~1h 大小细胞悬液 39000g, 20min 含微细胞上清液 无血清培养基悬浮 微细胞 滤膜过滤 分别离心 微细胞 微细胞 170 微细胞沉淀 线性梯度BSA悬浮 Fusion between minicells and accepted cells 微细胞与受体细胞融合 微细胞(百万个) 含植物凝集素P的无血清培养基 10~15min,37 ℃ 悬浮液 受体细胞 凝集 1 min 吸去植物凝集素P 加PEG1540 (30~50%) 吸去PEG液 加完全培养基 分装培养瓶 无血清培养基洗涤3次 16~24h, 37 ℃ 胰酶消化,收获离散细胞 选择培养基筛选 171 Directly Chromosome Transfer 直接转移染色体 ? 细胞同步化与染色体分离 秋水仙素处理 胰酶处理 离心 供体细胞 4 ℃,20min 细胞沉淀 37 ℃,10min 缓冲液洗涤 针筒喷射 破坏有丝分裂器 4 ℃,3000rpm,10min 染色体 细胞破碎液 密度梯度离心 分离大小染色体 流式细胞仪 172 Chromosome Transfer 染色体转移 ? 显微注射法 ? 细胞直接吞噬法 ? 染色体-磷酸钙共沉淀法 染色体悬液与CaCl2(2mol/L)按16:1混匀 20min 37 ℃,4h,CO2培育箱 滴入受体细胞 加入完全培养基(20mL) 30s 加二甲亚砜(30%)10mL 胰酶消化 收获细胞 加10mL新培养液 选择培养基 吸去培养液 173 ?Lipidsome packing 脂质体包装法 乙醚-氯仿-染色体悬液2mL 37 ℃旋转蒸发 混合 卵磷脂-胆固醇混合液 100 000g,30min 弃上清 染色体悬液,培养液 脂质体悬液 滴加 脂质体沉淀 2h 混悬液 受体细胞 24h 加PEG 吸去各液体 加新鲜培养液 选择培养基 174 作文 乙醚-氯仿染色体悬液配方

乙醚:氯仿=1:1 10 条染色体?mL-1 7 175 Prescription for chromosome suspension 染色体悬液配方 ? ? ? ? ? NaCl KCl K2HPO4 KH2PO4 无菌水定容 8.0 g 0.2 g 1.15 g 0.2 g 1000 mL 176 Section 6 Research on Human Stem Cell 第六节 人干细胞研究 干细胞是动物(包括人)胚胎 及某些器官中具有自我复制和多向 分化潜能的原始细胞,是重建、修 复病损或衰老组织、器官功能的理 想种子细胞。 177 Engineering of Stem Cell 干细胞工程 ? 上世纪五十年代,科学家在畸形胎瘤中首次发现 了胚胎干细胞(Embryonic Stem Cell, ESC),从 此开创了干细胞生物学研究的历程。

? 1970年,Martin Evans分离出小鼠胚胎干细胞并 在体外进行培养。

? 接着,科学家直接从病人的身上提取某种特殊的 细胞使之长成皮肤、骨胳和软骨,甚至是重要器 官的一部分,这类细胞就是干细胞。

? 1997年人的胚胎干细胞被首次培养成功,从而科 学家开始了尝试“定制”器官救助生命的干细胞 工 程,即非繁殖性克隆或治疗性克隆研究。

178 Types of Stem Cells 干细胞的类型 ? 全能性干细胞(胚胎干细胞); ? 多能性干细胞 ; ? 专一性干细胞; 179 Types of Stem Cells (1) ? 全能性干细胞

即受精卵及胚胎干细胞,是最原始的干细 胞,具有自我更新、高度增殖和多向分化发育 成为人体全部206种组织和细胞甚至形成完整 个体的分化潜能。当受精卵分裂发育成囊胚时, 内层细胞团的细胞即为胚胎干细胞。 180 Types of Stem Cells (2) ? 多能性干细胞:这种干细胞具有分化出 多种细胞、组织的潜能,但却失去了发 育成完整个体的能力,发育潜能受到一 定的限制。如骨髓造血干细胞可分化成 至少12种血细胞,但一般不能分化出造 血系统以外的其它细胞。(这种观点已 受到质疑) 181 Differentiation of Hematopoietic Stem Cell 造血干细胞分化 182 Types of Stem Cells (3) ? 专一性干细胞

这类干细胞只能分化成一种类型或 功能密切相关的两种类型的细胞,如上 皮组织基底层的干细胞、肌肉中的成肌 细胞等。

(这种观点已受到质疑) 183 Characters of Stem Cell ? 具有分裂成其它细胞的可能性; ? 具有无限增殖分裂的潜能; ? 可连续分裂几代,也可在较长时间内处 于静止状态; ? 以对称或不对称两种方式进行生长。 184 Three Steps on the Research of Stem Cell ? 获得干细胞系 ; ? 建立干细胞诱导分化模型 ; ? 将上述干细胞或干细胞培育体系植入 动物或人的相应器官或组织,考察其 效果。 185 Three Steps on the Research of Stem Cell (1) ? 获得干细胞系

这是本研究最重要的第一步。可以 从动物或人的早期胚胎或各器官、组织 中分离并经鉴定,且能在体外长期保持 干细胞特性(一般应稳定传25代以上); 186 Three Steps on the Research of Stem Cell (2) ? 建立干细胞诱导分化模型

可利用基因工程手段引入外源目的 基因(对原有致病基因进行置换改造), 探索诱导干细胞向特定组织、器官分化 的化学或/和物理条件; 187 Three Steps on the Research of Stem Cell (3) ? 将上述干细胞或干细胞培育体系植入动 物或人的相应器官或组织中,考察其效 果。 188 Therapy Comparison between Traditional and Stem Cell ①低毒性(或无毒性),一次治疗有效; ②不需要完全了解疾病发病的确切机理; ③用自身干细胞移植,可避免产生免疫 排斥反应; 189 Argue with Stem Cell ? Embryo Stem Cell; ? Somatic Stem Cell; 190 坑人?救人? ? 英国2000年通过了准许在严格管理的条 件下克隆人类早期胚胎进行干细胞研究; ? 美国总统布什在2001年8月宣布,美国政 府将仅仅支持对已有的胚胎干细胞进行 研究; ? 德国只允许研究2002年1月30日以前产生 的胚胎干细胞,而且还必须是在没有其 它可选择的情况下才能进行。 191 中国支持治疗性克隆研究 ? 中科院副院长陈竺院士2002年7月指出:“一 个体外的胚胎在有限的时间,如14天里,尚属 一般的生物细胞,此时还没有神经细胞和脑细 胞的产生,既无知觉也无感觉,因此科学界一 般认为它在此时还不是一个道德意义上的 人。……人类干细胞研究给21世纪医学的革命 性发展带来可能,因此总的平衡利弊,还是要 支持”。

? 陈竺副院长还强调,在支持的同时还要有严厉 的法律、法规来保证这样的技术发展能真正造 福人类。 192 前程无量的干细胞工程 ? 干细胞巨大的潜在应用价值引起世界许 多国家和机构的高度重视,他们投入巨 资进行研究,陆续取得了一系列重大的 发现,导致1999年12月美国《科学》杂 志将人类干细胞的研究评为当年十大科 学成就之首。 193 干细胞器官工程的难点 ? 地球重力限制了细胞的三维生长; ? 离体培养难以确保器官形成所需的多种 条件; ? 细胞间相互促进或抑制的机理尚未研究 清楚; 194 国际领先的徐荣祥 2002年08月:5年内克隆人体所有器官 195 国际领先的徐荣祥 ? 我国徐荣祥教授在皮肤干细胞原位再生 方面取得了原创性的重大突破。他们对 被烧伤的皮肤进行适当处理后,成功地 直接诱导上皮组织基底层的干细胞分化 生成皮肤细胞,使受伤的皮肤得以迅速 康复。该技术显示我国干细胞研究已率 先进入组织和器官的原位干细胞修复和 复制阶段,在国际上处于领先地位。 196 干细胞研究进展(1) ? 1998年Wisconsin大学的James Thomson和 Johns Hopkins大学的John Gearhart 首次从 人囊胚的内层细胞团中取得胚胎干细胞, 在体外可以进行长达5个月的非分化增殖, 同时还保持着分化为滋养层组织及三种 胚层组织的能力。

? 1999年Goodell等将小鼠肌肉干细胞体外 培养5天后,与少量的骨髓间质细胞一起 移植入接受致死剂量辐射的小鼠中,肌 肉干细胞会分化为各种血细胞。 197 干细胞研究进展(2) ? 2000年8月日本筑波大学把鼠肝干细胞体 外培养后移植到肝功能衰竭的鼠肝中, 40天后干细胞发育成新的肝组织,分泌 出鼠肝特异清蛋白。

? 2001年1月浙江大学药学院副院长楼宜嘉 教授等通过药物诱导在体外将胚胎干细 胞定向分化成心肌细胞,能搏动。

? 2001年8月中国西北农林科技大学窦忠英 等从人胚胎干细胞分化得到能跳动的类 心肌细胞。 198 干细胞研究进展(3) ? 2001年11月美国马萨诸塞州的先进细胞 技术公司Jose Cibelli 等用化学药物处理 77枚猴子的卵,其中4枚单性发育到囊胚 期,从中分离出干细胞,诱导它们形成 神经细胞、平滑肌细胞、心肌细胞和脂 肪细胞等,从而有助于跨越伦理道德的 障碍。

? 2001年12月美国人种起源研究所把人胎 盘干细胞转化成神经细胞、血细胞、软 骨细胞、皮肤细胞、肌细胞。 199 干细胞研究进展(4) ? 2002年2月日本京都大学再生医学科学研 究所用鼠胚胎干细胞培育出胰岛细胞, 并将它们转移到3只患糖尿病的实验鼠内, 一周后实验鼠的血糖值都正常。

? 2002年2月美国马萨诸塞州的先进细胞技 术公司从母牛耳朵取皮肤细胞的细胞核, 与去核卵电激融合,形成早期胚胎。取 出其中的胚胎干细胞,放在肾形可降解 “支架”上生长,获得外形和功能都似 牛肾的微型器官,可泌尿,存活数月, 不被排斥。 200 干细胞研究进展(5) ? 2002年3月剑桥大学乔治?戴利和鲁道夫? 耶尼施等对鼠胚干细胞的免疫缺陷基因 进行修复后,再将其植入鼠体,结果修 复了鼠的免疫系统缺陷。

? 2002年3月美国麻省理工学院罗伯特?兰 格等利用人胚干细胞培育出可能形成血 管的组织,将它们注入免疫抑制的鼠中, 未受排斥,14天后形成毛细血管网。

? 2002年4月美国医生从病人的骨髓中抽取 干细胞将其植入他的脑中,患者的帕金 201 森综合症明显好转。 干细胞研究进展(6) ? 2002年6月澳大利亚的莫纳什大学研究人 员在世界上首次利用人干细胞培育出完 整的功能齐全的胸腺。

? 2002年6月日本三菱化学生命科学研究所 桥本有弘等将人体肌肉干细胞诱导长成 骨细胞和脂肪细胞。

? 2002年7月美国的弗里德兰德等将实验鼠 骨髓的“内皮祖细胞”注入鼠眼,后者 会附着在视网膜内的星形细胞上,与原 有血管相结合形成新血管。 202 干细胞研究进展(7) ? 2002年9月美国波士顿弗西斯研究中心从 小猪体内提取牙齿干细胞,用酶催化后, 放入可降解牙模中,再植入小鼠腹部。

在30周内,这些细胞长成包含珐琅质和 牙质的牙冠。

? 2002年10月中国河北农业大学桑润滋教 授等在国内首次分离出山羊早期胚胎的 类胚胎干细胞和类生殖细胞,经培养、 分化试验,获得了类神经细胞和上皮细 胞。 203 干细胞研究进展(8) ? 2002年10月广州中山大学附属第二医院 黄绍良教授等在国内首次建立三个中国 人胚胎干细胞系CHE1、CHE2和CHE3, 并采用分阶段方法成功诱导小鼠胚胎干 细胞发育成造血干细胞。

? 2002年10月韩国与美国的科学家把干细 胞置于可被吸收的生化塑料小架子上, 再放到受中风严重破坏的老鼠脑部。

一 个月之内,干细胞形成了新的脑部组织, 还刺激原有的脑细胞生长。

受损的部位 已经大部分恢复。 204 干细胞研究进展(9) ? 2002年10月美国洛杉矶西达斯-西奈医学 中心通过转基因手段,开发出了能够分 泌“白细胞介素12”的神经干细胞。这种 干细胞既能追踪、又可杀灭转移和扩散 的脑肿瘤细胞。

? ?美国耶鲁大学的黛安娜?克劳斯等把鼠 骨髓干细胞培养成肺细胞、肝脏细胞、 肠细胞、皮肤细胞。

? ?加拿大多伦多大学在人、鼠、牛的视 网膜中发现并分离、培养出了视网膜干 细胞,它产生的新细胞可以被培养成修 复视网膜所需要的许多特定细胞。

205 干细胞研究进展(10) ? ?美国加利福尼亚州索尔克研究所的弗 雷德?盖奇等从新鲜尸体中提取脑细胞, 把它们培养成神经祖细胞——成年脑细 胞的前身。

? ?美国纽约医学院的皮耶罗?安书萨等利 用鼠骨髓修复了受损的老鼠心脏。

? ?美国威斯康星大学把胚胎干细胞培养 成血小板、红细胞和白细胞。

? ?美国哥伦比亚大学的西尔维乌?泰斯库 等利用人骨髓在老鼠心脏中生成新的血 管。 206 干细胞研究进展(11) ? ?美国洛杉矶加利福尼亚大学的马克?亨 德里克等利用吸脂手术时提取的脂肪细 胞仿制成软骨、骨和肌肉。

? ?美国佛罗里达大学从老鼠胰腺中分离 出干细胞,对它们进行实验室培养后将 其植入患有糖尿病的老鼠体内,使这些 老鼠恢复了制造胰岛素的功能。

? ?美国神经系统疾病与脑溢血研究所的 罗恩?麦凯等把老鼠的胚胎干细胞培养成 类胰岛细胞。 207 干细胞研究进展(12) ? 2003年7月上海第二医科大学盛慧珍等培 育出包含人兔DNA混合物的人兔混合胚 胎干细胞。

? 2003年9月美国克隆专家扎沃斯将人类的 DNA与一头母牛的卵细胞结合后,克隆 出“人牛胚胎”,已存活了两星期。(不 鼓励) 208 第七节 动物细胞工程进展 一. 雌核发育 ? o o o 精子遗传物质的灭活 显微手术法; 射线灭活法;X射线,紫外线,60Co; 化学灭活法:甲苯胺蓝,乙烯尿素,二 甲基硫酸; 210 二.阻止卵细胞早期分裂 ? 保留第二极体 通过提高外界压力或进行冷/休克,阻止 第二极体外排,重新与卵核结合成2n核; ? 阻止第一次有丝分裂 精子刺入,第二极体排出后,除去雄性原 核,以秋水仙素对单倍体卵核进行加倍。以后 阻止2n 卵进行第一次有丝分裂,并诱导其进 入G1期、S期和G2期。 211 三. 转基因动物 注射激素 外源基因 供体母鼠 受精卵 转基因卵 传代 取尾基因检测 取血蛋白检测 212 雄鼠交配 移放输卵管/子宫 幼鼠 转基因DNA的制备 ?高纯度,杜绝残留有机溶剂及颗粒; ?线性DNA整合效率5倍于超螺旋DNA; ?去除载体,基因表达水平显著提高; ?DNA浓度以1~3? g/ml,1~2nl为宜; ?DNA缓冲液:Tris.HCl,5~10mM,pH7.4, EDTA 0.1~0.25mM 213 转基因动物进展 ? 转生长激素基因

兔,猪,羊,鱼,泥鳅 ? 转白蛋白基因

“滔滔”乳腺工厂 ? 华裔科学家钱卓培育出转NR2B基因聪明鼠 转录 NR2B基因 NMDA神经蛋白 提高联想力,辨识事物的能力 214 Routine for artificial uterus manufacture 四.人造子宫研制思路 ? 利用子宫内膜细胞,制成子宫模型, 将胎儿胚胎移植到人工子宫内壁, 提供营养,让其生长。 215 五.人转基因治疗 ? 世界首例人转基因治疗

Desilva,女,4岁,患严重“免疫缺陷综合 征”,缺“腺苷脱氨酶基因”(ada)。

1990.9.14,抽血 分离T cells ada genes 与T cells共培养数日(转化) T cells输回体内 重复7次/10个月 每隔3~5个月再重复治疗 216 ada 基因突变儿童 217 Transgenic therapy 转基因治疗 218 复旦大学转基因治血友病(1991) 注入凝血因子基因 皮下成纤维细胞 转基因成纤维细胞 体外培养 皮下注射 转基因成纤维细胞 患者血中凝血因子浓度上升,出血症减轻 219 Chapter 4 Cell Engineering on Microorganisms 第四章 微生物细胞工程 ?微生物结构简单,生长迅速,操作方便; ?微生物的遗传背景研究比较深入; Fusion between prokaryote protoplasts 第一节 原核细胞的原生质体融合 一. 细菌细胞壁组成: 1.革兰氏阳性菌(G+)的细胞壁组成

肽聚糖层占细胞壁90%; -M-G-M-G-M-G-M-G-M-G短肽 -M-G-M-G-M-G-M-G-M-GM:N-乙酰胞壁酸, G

N-乙酰葡萄糖胺 短肽:L-丙氨酸,D-谷氨酸,赖氨酸,D-丙氨酸, 二氨基庚二酸; 221 Cell Wall Constitution of Grampositive Bacteria 2. 革兰氏阴性(G-)细胞壁组成 ? 肽聚糖,5~20% ? 脂多糖,70~80% 222 Lysozyme and its characters 二.溶菌酶及其特性 ? ? ? ? ? 普遍存在,新鲜蛋清中可达0.3%; 分子量14.3 KD,等电点11.1; 最适pH 5~9; 热稳定,100℃ 1 min不失活; 特异切断肽聚糖中N-乙酰胞壁酸与N-乙 酰葡萄糖胺之间的β-1,4-糖苷键,使菌 壁解体; 223 ? 溶菌酶可分解G+壁; ? 溶菌酶要分解(G-)壁须添加EDTA· 2 Na (乙二胺四乙酸); ? 提高溶菌酶作用效率的因素

o 菌龄

指数生长期; o 预处理

酸,碱,热,冷,表面活性剂, 巯基乙醇,丙酮,三氯乙酸,EDTA· 2 Na 224 溶菌酶,恋人的保护神? ? 华裔美国人李小枫、陈浩佳发现,接吻 不会传染艾滋病的原因

唾液中的溶菌酶会分解HIV外壳上 糖蛋白中的糖类,导致病毒死亡。 225 Regeneration of Protoplasts 三.原生质体再生 ? 在蔗糖-镁-顺丁烯二酸-牛血清蛋白 (BSA)培养基中,枯草杆菌原生质体能 几乎全部再生; ? 原生质体的浓度不能太高——自我抑制 现象; ? 加入灭活菌或其细胞壁可明显提高原生 质体的再生率。 226 Protoplast Fusion on Gram-positive bacteria 四.革兰氏阳性菌的原生质体融合 ? 融合的前提:具有可识别标志。

? 在高渗培养基中进行。 227 HM高渗液 ? ? ? ? ? ? 蔗糖 68.46 g Tris 12.0 g NH4Cl 1.0 g KH2PO4 0.14 g L-亮氨酸 0.05 g 蒸馏水 1000mL 葡萄糖 2.0 g MgCl2· 2O 4.26 g 5H Na2SO4 · 2O 0.3g 10H NaCl 0.058 g KCl 0.035 g pH 7.5 228 The main steps of Gram-positive bacteria fusion 1.革兰氏阳性菌融合的主要步骤 实验菌 30℃振摇 5╳107CFU · -1 mL 加溶菌酶 混合双亲本 离心 菌沉淀 HM液悬浮 ~30min 菌悬液 双亲本溶菌液 离心 双亲本原生质体 原生质体沉淀 融合细胞 检验 229 加1/10体积 HM液 加PEG6000(40%) 原生质体凝集 ~1min HM液适量稀释 融合子悬浮液 筛选 传代 融合子 Factors effecting on the increasing frequency of fusants 2.提高融合子产生频率的因素 ? ? ? ? Age of bacteria:Which station? Addition of glycine

Substitute some of alanine; Penicillin treatment:0.3U /mL-1; Use of lower nutrient medium; 230 2.提高融合子产生频率的因素 ? “钝化”融合法 灭活供体方的原生质体,再进行融和。

? 优点:受体方所受影响较小; 供方不必具备特殊的生理或遗传 标记; ? 缺点:融合频率不高; 231 五.Spheroplasts Preparation of Gram-negative bacteria cultivation E.coli Suspension centrifuged pellets 37℃ shaken (OD450=0.9) washed two times by 10mM Tris(pH8.0) buffer centrifuged pellets LysozymeE.coli suspension spheroplasts 232 add 100mM Tris(pH8.0) buffer(including sucrose 20%,W/W) Suspension 37℃ shaken 1min add lysozyme (final con.100? /mL) g 37℃ shaken gently 12min 37℃ shaken gently 12min add 0.1mol /mL EDTA?Na2 , 1 / 10 volume 六. Fusants Screening(1) 1.Principle

1) 营缺法:产生原养型; 产生新的重组缺陷型; 2) 抗药标记法: 233 六. Fusants Screening(2) 2.Detection

1) Direct method:融合后培养1h,直接涂 布在高渗screen medium; 2) Indirect method:融合后先高渗培养, 待再生出细胞壁后再筛选; 两种方法的比较 234 七.计算 Calculation 原生质体(球)数 ×100% 原生质体(球)形成率= 总菌数 总菌数-非原生质体数 = 总菌数 融合子数 融合率= 能再生的亲本原生质体数 235 ×100% ×100% 七.计算 Calculation 再生原生质体数 ×100% 原生质体再生率= 原生质体数 再生菌数-非原生质体数 = 原生质体数 236 × 100% Fusion between eukaryote protoplasts 第二节 真核微生物的原生质体融合 一. Yeast Protoplasts Fusion ? 1959年,Eddy首先用蜗牛消化液成功制 得yeast protoplasts. ? 1977年,Sipigki首先发表裂殖酵母同型 接合型protoplast fusion. ? 至今科学家已经进行了数十种种内、种 间和属间的protoplast fusion. 237 1.Yeast Protoplast Preparation ? Constitution of the Cell Wall of Yeast

包括各种葡聚糖纤维网状物、甘露 聚糖、蛋白质和脂质等; ? Enzymes for Digesting Yeast Cell Wall

Zymolase(0.3mg?mL-1), Drislase, Cellulase, 蜗牛酶,壳质酶等; 238 1.Yeast Protoplast Preparation 30℃,16-18 h Yeasts(YPD medium) suspension shaken washed by sterilized water centrifuged suspension pellets add zymolase et al,pH 7.5 30℃, shaken gently 2-4 h Y-E suspension protoplasts washed by 0.6mol ?L-1 KCl protoplasts 239 2. Fusion According to the High Ca+-High pH procedure PEG4000 CaCl2 pH 7.5 20-40% 50 mol ?L-1 240 Results of Fusion ? ? ? ? 杂合双倍体

abcDEF / ABCdef 单倍重组体 :ABCDEF 或 abcdef 部分重组体 :ABCDef 等 异核体:暂时融合或形成胞内多核 注:真菌一般为单倍体 241 3.Regeneration of fusants—— formation of cell wall ? ? ? ? ? Using agar medium is more suitable; Adding yeast extraction and BSA; Less density of protoplast; β-巯基乙醇的使用浓度不宜过高; 酶作用时间不宜过长; 242 4.Analyses of Fusants ? 核标记分析 ?细胞核染色:融合成一个核或异核体; ?DNA含量测定; ?染色体核型分析; ?营养缺陷型纠正分析; 243 4.Analyses of Fusants 胞质标记分析 ? 抗药性检测:由胞质中的质粒决定; ? 呼吸缺陷的纠正:缺线粒体的酵母仍可 呼吸,移入线粒体可大大提高呼吸效率; 244 4.Analyses of Fusants ? 生化分析: ?特定代谢产物的量与质的分析; ?蛋白质电泳分析; 245 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (1) ? 脱壁酶: o o o o o o 消解酶(zymolase) 新酶(novozyme) 纤维素酶(cellulase) 几丁质酶(chicinase) 解螺旋酶(helicase) β-d-葡萄糖苷酸酶(β-d-glucuronidase) 246 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (2) ? 高渗稳定剂: o NaCl, 0.6-0.8 mol ?L-1 o 0.6 mol ?L-1 NaCl or KCl, including 0.2 mol ?L-1 phosphate buffer(pH5.8); o 0.6 mol ?L-1 MgSO4; 247 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (3) ? Isolation of protoplasts ?Filtrate ? ?Centrifuge ? 248 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (4) ? Protoplast Fusion o o o o o PEG4000-6100 25-30% , 5min; CaCl2 0.01 mol?L-1 ; Glycine 0.05 mol?L-1 ; pH 7.0-7.5 Temperature 30-37℃; 249 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (5) ? Regeneration of Protoplasts 含葡萄糖和壳多糖的高渗培养基 250 二.Protoplast Fusion of Filamentous fungi (6) ? Fusants Screening o Methods

direct or indirect o Principle(1)营养缺陷型互补; (2)抗药性标记; (3)应用非选择标记

菌落形态,生长速度,孢子颜色, 孢子形态,代谢产物,(色素、抗生素、 同工酶); 251 《细胞工程》复习提要(1) ? ? ? ? ? ? ? 重视术语概念; 重视无菌操作; 动物及植物细胞培养; 植物细胞次级代谢物生产; 植物组织培养; 植物脱病毒; 单倍体植株培育; 252 《细胞工程》复习提要(2) ? PEG法细胞融合; ? 融合子筛选的原理; ? 哺乳动物体细胞克隆; ? 干细胞研究; 253 考试时间:5月29日(周日)上午 8:30——10:30 考试地点:博二 203 254

第一篇:细胞工程

2.2.2 动物细胞融合与单克隆抗体 植物体细胞杂交的意义

打破生殖隔离,克服远缘杂交不亲和的障碍, 培育作物新品种。 一、动物细胞融合 细胞融合是正常的生命活动。 受精作用 两个细胞正在融合 (一)动物细胞融合的概念 动物细胞融合也称细胞杂交,是指两个或多 个动物细胞结合形成一个细胞的过程。

杂交细胞:融合后形成的具有原来两个或 多个细胞遗传信息的单核细胞。 (二)动物细胞融合的过程 与植物原生质体融合原理相同,方法类似。 细胞A 物理法 化学法 细胞B 灭活的病毒 杂种细胞 用灭活的病毒诱导动物细胞融合过程 病毒颗粒 细胞核 细胞核 灭活的病毒颗粒黏附于细胞表面 细胞膜被病毒颗粒穿通 细胞膜连接 细胞融合,形成杂种细胞 (细胞膜具有一定的流动性) 两个核的融 合是在杂种 细胞第一次 有丝分裂时 进行的 ?为什么灭活的病毒能作为诱导剂? 因为灭活的病毒能使细胞膜上的蛋白质分 子和脂质分子重新排布,细胞膜打开,细 胞发生融合。 ?不灭活的病毒能作为诱导剂吗? 不能,因为不灭活的病毒会感染细胞。

动物细胞融合技术的发展简史 (三)动物细胞融合的应用 1.突破有性杂交方法的局限,使远缘杂交成为 可能。 鼠—鸡、鼠—兔、鼠—猴、人—鼠、人—兔、 人—鸡、人—蛙、酵母菌—鸡 、人—胡萝卜等 2.成为研究细胞遗传、细胞免疫、肿瘤和生物 新品种培育等的重要手段。

3.为制造单克隆抗体开辟了新途径。 植物体细胞杂交、动物细胞融合的比较 比较项目 植物体细胞杂交 动物细胞融合 原理 细胞融合的方法 细胞膜的流动性、 细胞膜的流动性 植物细胞全能性 去除细胞壁后诱 导原生质体融合 物理(离心、振 动、电激) 使细胞分散后 诱导细胞融合 诱导方法 物理、化学方法 (同左) 化学(聚乙二醇) 灭活的病毒 获得杂种植株 主要用于制备 单克隆抗体 用途 二、单克隆抗体 什么是抗体? 抗体是机体受抗原刺激后产生的、 并能与该抗原发生特异性结合的具有 免疫功能的球蛋白。

B淋巴细胞(浆细胞)能产生抗体。 (一)获得抗体的传统方法 1、把某种抗原反复注射到动物体内,然后 从动物血清中分离出所需的抗体。

2、缺点: 产量低,纯度低,特异性差。 人们发现,在动物发生免疫反应的过程中, 体内的B淋巴细胞可以产生多达百万种以上 的特异性抗体,但是每一个B细胞只分泌一 种特异性抗体。要想获得大量的单一抗体, 必须克隆单一的B淋巴细胞,形成细胞群。 1、请从以上文字资料中找出单克隆抗体的概念 用单个B淋巴细胞进行克隆,得到的细胞群能够分 泌一种化学性质单一、特异性强的抗体,这种抗体 就叫做单克隆抗体。 2、怎样才能获得单克隆抗体? 提示1:仅用细胞培养技术可行吗? 提示2:我们所学的哪种细胞是可以无限增 殖的? 提示3:有什么方法能使B细胞产生抗体的能 力和肿瘤细胞无限增殖能力同时具备呢? 如何大量生产单克隆抗体? ?利用B淋巴细胞产生抗体的功能。

?利用肿瘤细胞无限增殖的特性。

?利用细胞融合的技术将两种细胞融 合获得具有B淋巴细胞和肿瘤细胞 特性的杂交瘤细胞。

?利用动物细胞培养技术大量培养杂 交瘤细胞。 ( 二 ) 单 克 隆 抗 体 的 制 备 整个制备过程为何要经过两次筛选? 第一次筛选:用特定的选择培养基筛选出多种 杂交瘤细胞 第二次筛选(克隆化培养和抗体检测):筛选 出能产生所需抗体的杂交瘤细胞。 如何进行杂交瘤细胞的抗体检测及克隆化培养? 融合后的细胞经选择性培养基培养后,能存活的细胞就 是杂交瘤细胞。但这些杂交瘤细胞并非都是能分泌所需 抗体的细胞,通常用“有限稀释法”来选择。将杂交瘤 细胞稀释,用多孔细胞培养板培养,使每孔细胞不超过 一个,通过培养让其增殖。然后检测各孔上清液中细胞 分泌的抗体(常用酶联免疫吸附试验法),那些上清液 可与特定抗原结合的培养孔为阳性孔。阳性孔中的细胞 还不能保证是来自单个细胞,挑选阳性孔的细胞继续进 行有限稀释,一般需进行3~4次,直至确信每个孔中增 殖的细胞为单克隆细胞。该过程即为杂交瘤细胞的克隆 化培养。 在多孔培养板上,在每孔只有一个杂交瘤 细胞的情况下,培养得到的细胞群是单个 杂交瘤细胞克隆得来的,所以产生的抗体 必然是化学性质单一的,特异性强的单克 隆抗体。这里的单克隆确有单个细胞克隆 的含义,只不过克隆的不是B淋巴细胞,而 是杂交瘤细胞。 杂交瘤细胞既能迅速大量繁殖,又能产生 专一抗体。 单克隆抗体的概念: 由单个杂交瘤细胞进行无性繁殖,也就是通过 克隆,形成细胞群,这一细胞群所产生的化学 性质单一、特异性强的抗体称为单克隆抗体。 注射抗原 B淋巴细胞 骨髓瘤细胞 细胞融合、筛选 杂交瘤细胞 细胞培养 筛选,继续培养 足够数量的、能产生 特定抗体的细胞群 体外培养 注射到小鼠腹腔 单克隆抗体 为什么不用两个而要用多个细胞进行动物细 胞间的融合? 就目前常用的细胞融合方法来看,不管是用物理 的、化学的方法,还是生物的方法,其融合率都 不可能是100%。仅用两个细胞融合,其效率太低, 不一定能得到融合细胞。更重要的是,即使两个 细胞已发生融合,但并不一定是研究者期望得到 的细胞类型。目前动物细胞融合技术最有价值的 应用就是单克隆抗体的制备。 我们以制备单克隆抗体为例来说明这一问题。

我们知道,体内产生的特异性抗体种类可多 达百万种以上,但是每一个B淋巴细胞只分泌 一种特异性抗体,如果仅取一个脾细胞(含B 淋巴细胞)和一个瘤细胞杂交,我们不能确 定该脾细胞分泌的抗体是否正是我们所需要 的;若用大量的脾细胞和瘤细胞进行融合, 就可以从融合细胞中筛选出能分泌所需抗体 的杂交瘤细胞。 (三)单克隆抗体的应用 与常规抗体相比,单克隆抗体特异性强, 灵敏度高,并可大量制备。

应用主要有

1、作为诊断试剂 准确、高效、简易、快速 2、用于治疗疾病和运载药物 把抗癌细胞的单克隆抗体与药物相结合, 制成“生物导弹”。 资料: 目前世界各国已经研制出数以百计的单克隆 抗体。许多缺乏良好诊断手段的传染病、免疫 性疾病、血液病、内分泌疾病和遗传病,用单 克隆抗体作为诊断手段,是一个必然趋势。另 外,用单克隆抗体做体内诊断,借以鉴别和定 位体内“病灶”也引起人们的注意,目前,主 要用于肿瘤追踪及心肌梗塞的诊断。 思考与探究 1.植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术有 什么不同? 植物体细胞杂交技术与动物细胞融合技术 基本相同,不同的是植物体细胞融合前需 去掉细胞壁,然后再融合;动物细胞融合 是两个体细胞直接融合。 2.制备单克隆抗体时,为什么要选用B淋巴细 胞和骨髓瘤细胞融合形成杂交瘤细胞? 哺乳动物感染抗原后,其体内会形成相应的B淋巴细 胞,B淋巴细胞能分泌相应的抗体凝聚或杀死这些抗 原。动物在免疫反应的过程中,每一种B淋巴细胞能 分泌一种特异性抗体,要想获得大量的特异性抗体, 必须使能分泌该单一抗体的B淋巴细胞大量增殖。B淋 巴细胞具有产生单一抗体的能力,但不能在体外增殖; 骨髓瘤细胞是一种癌细胞,它能在体外培养条件下无 限增殖,但不能产生抗体。因此,把一种B淋巴细胞 与骨髓瘤细胞进行细胞融合,产生杂交瘤细胞,它会 兼有两个亲本细胞的特性──在体外培养条件下能不 断增殖,同时能产生出某种特异性的抗体。 1.在动物细胞融合和植物体细胞杂交的比较中,正 确的是( B ) A.结果是相同的 B.杂种细胞的形成过程基本相同 C.操作过程中酶的作用相同 D.诱导融合的手段相同 2. 单克隆抗体制备过程中,骨髓瘤细胞和B淋巴细胞 诱导融合后,要用特定培养基筛选出杂交瘤细胞,在 这种培养基上不能存活增殖的细胞是( C ) ①淋巴细胞 ②小鼠骨髓瘤细胞 ③B淋巴细胞自身融合细胞 ④小鼠骨髓瘤细胞自身融合细胞 ⑤杂交瘤细胞 A. ②④ C. ①②③④ B.①③⑤ D.②③

第一篇:细胞工程

专题2 细胞工程 什么叫细胞工程? 细胞工程是指应用细胞生物学和分子 生物学的原理和方法,通过细胞水平或细 胞器水平上的操作,按照人们的意愿来改 变细胞内的遗传物质或获得细胞产品的一 门综合科学技术。 按操作对 象分类 植物细胞工程 动物细胞工程 2.1植物细胞工程 §2.1.1植物细胞工程的基本技术 植物组织培养技术 植物组织培养的理论基础

植物细胞的全能性 (一) 细胞的全能性 1、定义:生物体的细胞具有使后代细胞形成完整个 体的潜能的特性。 2、原理:生物体的每一个细胞都包含有该物种所特 有的全套遗传物质,都有发育成为完整个 体所必需的全部基因,从理论上讲,生物 体的每一个活细胞都应该具有全能性。 3、差异

(1) 受精卵的全能性最高 (2) 受精卵分化后的细胞中,体细胞 的全能性比生殖细胞的低。 4、生物体所有细胞全能性大小都一致吗? 受精卵>生殖细胞>体细胞; 植物细胞>动物细胞 回忆、思考 1、植物组织培养的大致过程包括哪几个阶段? 离体的器官、组织或细胞 再分化 脱分化 愈伤组织 根和芽 发育 完整植株 2、什么是脱分化? 由高度分化的植物器官、组织或细胞产生愈伤组 织的过程,又称去分化。 3、什么叫愈伤组织? 离体的植物器官、组织或细胞,在培养一段时间 以后,通过细胞分裂,形成一种高度液泡化、无定形 状态薄壁细胞组成的排列疏松无规则的组织。

4、什么叫再分化? 脱分化产生的愈伤组织在培养过程中重新分化根 或芽等器官的过程。 一、植物组织培养技术 1、植物组织培养的过程 阅读P34的实验,回答问题: 1.植物细胞表现出全能性的条件有哪些? 2.在植物组培过程中,为什么要进行一系列的消 毒,灭菌,并且要求无菌操作? 3、为什么切取胡萝卜根的形成层,其他部分也能 培养成小植株吗? 4、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养? 5、决定植物脱分化、再分化的关键因素是什么? 6、请同学们概括出植物组织培养技术的流程图。 想一想 1.植物细胞表现出全能性的条件有哪些? 细胞离体、一定的营养物质、 激素和其他外界条件 避免杂菌在上面迅速生长消耗营养, 且有些杂菌会危害培养物的生长。 3、为什么切取胡萝卜根的形成层,其他部分也能 培养成小植株吗? 2.在植物组培过程中,为什么要进行一系列的消毒, 灭菌,并且要求无菌操作? 其形成层容易诱导成愈伤组织,其他部分如 叶、花也能培养成小植株,只是稍微困难些。 4、为什么诱导愈伤组织的过程中应避光培养? 在有光时,往往容易形成维管组织, 而不易形成愈伤组织。 5、决定植物脱分化、再分化的关键因素是什么? (P43) 植物激素。 一般,当生长素含量高于细胞分裂素时,有利于根的形成。 当生长素含量低于细胞分裂素时,有利于芽的形成。 6、请同学们根据上述过程概括出植物组织培养 技术的流程图,并与同学交流。 切取 形成层 移栽 无菌 接种 脱分化 诱导愈伤组织 的形成 再分化 培养室 试管苗的形成 植物组织培养简图: 离体的器官、组织或细胞 脱分化 激素、营养 再分化 激素、光 愈伤组织 根和芽 发育 完整植株 根据上述过程,请同学们讨论归纳出组 织培养的概念。 2、植物组织培养的概念

植物组织培养就是在无菌和人工控制条件 下,将离体的植物器官、组织、细胞,培 养在人工配制的培养基上,给予适宜的培 养条件,诱导其产生愈伤组织、丛芽,最 终形成完整的植株。 植物组织培养的培养基 定义:含有一定营养成分,供组织培养植物 生长的基质 ? 无机营养成分:C,H,O大量元素及部分微量 元素 ? 有机营养成分 ① 含N物质:包括维生素和氨基酸 ② 碳源:2%—5%的蔗糖 ③ 琼脂:起支持作用 ④ 相关激素:生长素,细胞分裂素和赤霉素 ? PH值:5.0-6.0 ? 再强调几个概念: 愈伤组织:离体的植物器官、 组织或细胞,在培养一段时 间以后,通过细胞分裂,形 成一种高度液泡化,由无定 形状态薄壁细胞组成的排列 疏松无规则的组织。 植物细胞的脱分化:由高度分化的植物器 官、组织或细胞产生愈伤组织的过程,又 称去分化。 脱分化的实质和结果分别是什么? 实质是恢复细胞的全能性过程。 结果是形成愈伤组织。 植物细胞的再分化:脱分化产生的愈伤组织在 培养过程中重新分化成根或芽等器官的过程。 反馈练习 1.在离体的植物器官、组织或细胞脱 分化形成愈伤组织的过程中,下列 哪一项条件是不需要的( C ) A.消毒灭菌 B.适宜的温度 C.充足的光照 D.适宜的养料和激素 2.要将胡萝卜韧皮部细胞培养成完 整植株,不需要( C ) A.具有完整细胞核的细胞 B.离体状态 C.导入外源基因 D.一定的营养物质和激素 3、植物组织培养形成的愈伤 组织进行培养, 又可以分 化形成根、芽等器官,这一 过程称为: A、脱分化 B、去分化 C、再分化 D、脱分化或去分化 4、下列不能作为植物组织培养 的材料是 A、秋海棠的叶 B、马铃薯的块茎 C、成熟的花粉 D D、木质部中的导管细胞 二、植物体细胞杂交技术 这幅番茄—马铃薯图利 用传统有性杂交方法能 实现吗?为什么? 因为不同种生物之间存 在着生殖隔离,所以用 传统的有性杂交方法是 不可能做到这一点的。

于是,这些科学家试图用这两种植物的体 细胞进行杂交,来实现这一美妙的设想。 (1) 植物体细胞杂交 过程示意图 (2) (3) (1) (5) (4) 请同学们阅读P36,思考以下几个问题: ? 1.有没有一种温和的去壁方法呢? ? 2.为什么两个原生质体能发生融合,这 与细胞膜的什么特性有关? ? 3.如果两个来源不同的原生质体发生了 融合,下一步该做何处理? ? 4.如何将杂种细胞培育成杂种植株? 二、植物体细胞杂交技术 1、过程 植物细胞A 去壁 植物细胞的融合 方法? 融合 完成 的 标志 植物组织培养 原生质体A 原生质体B 去壁 人 工 诱 导 融合的 原生质 体AB 杂种 细胞 脱 再 AB 分 生 出 细 胞 壁 化 愈 伤 组 织 再 分 化 杂 种 植 株 植物细胞B 促进融合 的方法? 细胞融合的基础: 细胞膜的流动性 去壁的常用方法

酶解法(纤维素酶、果胶酶等) 物理法:离心、振动、电刺激等 原生质体融合方法

化学法:聚乙二醇(PEG) 2、概念 将不同种的植物体细胞,在一定条件下 融合成杂种细胞,并把杂种细胞培育成新 的植物体的技术。 3、优势和未解决的问题 优势(与有性杂交方法比较) :打破了不同 种生物间的生殖隔离障碍,大大扩展了可 用于杂交的亲本组合范围。 未解决的问题:未能让杂种植物按照人们 的需要表现出亲代的优良。 1972年卡尔森等通过两个烟草品种之间 原生质体的融合,获得了第一个体细胞杂种。

1978年梅尔彻斯(Melchers)等首次获得 了番茄和马铃薯的属间体细胞杂种—— “Potamato”。 目前,已得到栽培烟草与野生烟草、 栽培大豆与野生大豆、籼稻与野生稻、 籼稻与粳稻、小麦与鹅冠草等细胞杂种 及其后代,获得了有价值的新品系或育 种上有用的新材料。 白菜 甘蓝 白菜-甘蓝 比较 植物组织培养 所属 范畴 原理 无性繁殖 细胞全能性 ①脱分化 ②再分化 植物体细胞杂交技术 染色体变异、基因重组 细胞的膜流动性 细胞全能性 ①去除细胞壁 ②融合形成杂种细胞 ③组织培养 步骤 保持优良性状 意义 繁殖速度快、大规模生产 克服不同种生物远源杂交 的障碍 提高经济效益 联系 植物体细胞杂交技术应用了植物组织培养技术 小结 植 物 细 胞 工 程 所采用技术 的理论基础 植物细胞的全能性 通常采用的 技术手段 植物组织培养 植物体细胞杂交 P38思考与探究 1.为什么“番茄—马铃薯”超级杂种植株没有 如科学家所想像的那样,地上长番茄、地下结 马铃薯? 主要原因是:生物基因的表达不是孤立的,它 们之间是相互调控、相互影响的,马铃薯—番茄杂 交植株的细胞中虽然具备两个物种的遗传物质,但 这些遗传物质的表达受到相互干扰,不能再像马铃 薯或番茄植株中的遗传物质一样有序表达,所以杂 交植株不能地上长番茄、地下结马铃薯。 2.自然界中有一种含有叶绿体的原生动物──眼虫,说明植物的 细胞器同样可以在某些动物细胞中存活,请探讨:动物细胞与植 物细胞之间可以实现杂交吗?如果理论上可行,请设计出具体实 验方案。 反馈练习 1、植物体细胞杂交尚未解决的问题有

A、去掉细胞壁,分离出有活力的原生质 体 B、将杂种细胞培育成植株 C、让杂种植物按照人们的需要表现出亲 代的优良性 D、尚未培育出属间杂种植物 2、不能人工诱导原生质体融合的方 法是 A、振动 C、PEG试剂 B、电刺激 D、重压 3.植物细胞表现出全能性的必要条 件是 A. 给予适宜的营养和外界条件 B. 导入其他植物细胞的基因 C. 脱离母体后,给予适宜的营养 和外界条件 D. 将成熟筛管的细胞核移植到去 核的卵细胞内 4、植物体细胞融合完成的标志是 A.产生新的细胞壁 A B.细胞膜发生融合 C.细胞质发生融合 D.细胞核发生融合 5、用不同种植物的两个体细胞融合成一 个杂种细胞的过程。该过程是指 A.不同植物的精子和卵细胞的融合 B.不同植物的原生质体的融合 B C.完整的两个体细胞的融合 D.植物花粉细胞的两两融合 6、右图为植物体细胞杂交过程 示意图。据图回答: 去掉细胞壁分离出有 1)步骤①是________________ 活力的原生质体 __________________________ 酶解法 最常用的方法是_________. 2)步骤②一般常用的化学试剂是 聚乙二醇(PEG) 目的是______ ______________ 诱导原生质体融合 _____________. 3)在利用杂种细胞培育成为杂种 植株的过程中,运用的技术手段 植物组织培养 ,其中步骤④相 是___________ 脱分化,步骤⑤相当于_____ 再分化 当于_____ 6、右图为植物体细胞杂交过程 示意图。据图回答: 4)植物体细胞杂交的目的是获得 新的杂种植株。使____________ 两个亲本的遗传性状 能够在新的植物体上有所表现, 其根本原因

杂种植株获得了双亲的遗传物质 5)从理论上讲,杂种植株的育性 _____ 可育 。若运用传统有性杂交方法 不能 。并说明理由

能否实现?_____ 因为不同种生物之间存在生殖隔离 因此,这项研究对于培养作物新品 种方面的重大意义在于

克服远缘杂交不亲和的障碍,大大扩展了 可用于杂交的亲本组合范围 . 以下待用 7.基因型为AaBb的水稻(含24条染色体)的花药通过 无菌操作接入试管后,在一定条件下形成试管苗,问 : (1)愈伤组织是花粉细胞不断分裂后形成的不规 则的细胞团,愈伤组织形成过程中,必须从培养基 水、无机盐、维生素和小分子有机物 等营养物质。

中获得___________________________ (2)要促进花粉细胞分裂生长,培养基中应有_ 细胞分裂素 和________________ 植物生长素 __________ 两类激素。 (3)愈伤组织分化是指愈伤组织形成芽和根,再由 芽发育成叶和茎。这一过程必须给予光照,其原因 叶绿体 是_____________ 能利用光能制造有机物,供试管 苗生长发育。

24 条脱氧核糖核苷酸链。

(4)试管苗的细胞核中含_____ (5)培育成的试管苗可能出现的基因型有 AB 、aB、Ab、ab 。

_____________

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