粗蛋白质

发布时间:2015-06-12 来源: 粗蛋白质是什么

第一篇:粗蛋白质

粗蛋白质的测定 蛋白质是评价饲料营养价值的重要 指标。

指标。

蛋白质含量测定也就成为饲料质量 检测中具有重要意义的常规项目。

检测中具有重要意义的常规项目。 蛋白质种类繁多,结构复杂, 蛋白质种类繁多,结构复杂, 精确的测定难度较大。

精确的测定难度较大。 但各种蛋白质都有其共同的特 含有一定比例的氮 点——含有一定比例的氮。

含有一定比例的 长期以来,人们用测定总氮量 总氮量的 长期以来,人们用测定总氮量的 方法,根据饲料中氮与蛋白质的比例 方法, 关系,推导出蛋白质的含量。

关系,推导出蛋白质的含量。

出蛋白质的含量 问题是,并非只是蛋白质才含氮, 问题是,并非只是蛋白质才含氮, 还有一些非蛋白质的化合物亦含氮( 还有一些非蛋白质的化合物亦含氮(如核 酸、生物碱、氨基酸、酰胺、硝酸盐及铵 生物碱、氨基酸、酰胺、 盐等)。

盐等)。

所以,用测定总氮量反推出来的, 所以,用测定总氮量反推出来的, 包括了 实际上包括 纯蛋白质和 实际上包括了纯蛋白质和非蛋白质含氮物 氨化物)。

(氨化物)。 粗蛋白质——饲料中 粗蛋白质——饲料中 含氮化合物的总称,包括 含氮化合物的总称, 纯蛋白质和氨化物。

纯蛋白质和氨化物。 推算系数6.25的由来

推算系数6.25的由来

6.25的由来 资料中常见在粗蛋白质这一名词后加注 (N×6.25) × ) 各种饲料蛋白质的含氮量由14.7~19.5%不 各种饲料蛋白质的含氮量由 不 平均为16%,即 等,平均为 , 克蛋白质平均含16克氮 每100克蛋白质平均含 克氮 克蛋白质平均含 而每测出1克氮,意味着存在100/16克蛋 而每测出 克氮,意味着存在 克蛋 克氮 白质, 白质,即 1克氮相当于 6.25 克蛋白质 克氮相当于 粗蛋白质测定最常用凯氏定氮法 凯氏定氮法, 粗蛋白质测定最常用凯氏定氮法,1833 年由凯达尔( 年由凯达尔(Kjlehl)首创,至今仍广泛应用 )首创, 于土壤,肥料,饲料,食品分析中。

于土壤,肥料,饲料,食品分析中。

我国现行的国家标准亦将此法列为饲料 粗蛋白质测定的法定方法。 原理 消化 在催化剂帮助下,用硫酸破坏有机物, 在催化剂帮助下,用硫酸破坏有机物, 使含氮物转化为硫酸铵。

使含氮物转化为硫酸铵。

2CH3CHNH2 COOH +13H2SO4 —————— (NH4)2SO +6CO2 +12SO2 +16H2O 蒸馏 加入强碱并蒸馏, 加入强碱并蒸馏,使氨逸出 (NH4)2SO4+2NaOH 2NH3 +2H2O +Na2SO4 用硼酸吸收 NH3 +4H3BO4 ———— NH4HB4O7 +5H2O 滴定 硼酸吸收氨后,用酸滴定 硼酸吸收氨后, NH4HB4O7 +HCl + 5H2O NH4Cl +4H3BO4 测出样品含氮量, 测出样品含氮量,乘以氮与蛋白质的 换算系数6.25,计算粗蛋白质的含量 , 换算系数 操作步骤 称样—— 消煮 消煮—— 蒸馏 蒸馏———滴定 称样 滴定 称样 准确称取样品0.5~1克 准确称取样品 克 (过40目筛) 目筛) 过 目筛 加催化剂 (K2SO4 6克,CuSO4 0.4克) 克 克 加浓硫酸12ml – 消煮时加入各试剂的作用 浓硫酸——分解有机物,使氨固定 分解有机物, 浓硫酸 分解有机物 为硫酸铵。

为硫酸铵。

硫酸钾或硫酸钠——增温剂,使硫 增温剂, 硫酸钾或硫酸钠 增温剂 酸沸点由317℃升至325-341℃。

℃升至325-341℃。

酸沸点由 325 硫酸铜——作催化剂、指示剂。

作催化剂、指示剂。

硫酸铜 作催化剂 (其他催化剂:Se,Hg,HgO,H2O2等) 其他催化剂: 消煮时样品颜色变化

消煮时样品颜色变化 黑色(稠糊状) 褐红色——黄褐色 黄褐色— 黑色(稠糊状)——褐红色 褐红色 黄褐色 —黄绿色 黄绿色——蓝绿色(澄清) 蓝绿色( 黄绿色 蓝绿色 澄清) 铜在消化过程中的颜色 CuSO4+ C + H+________ Cu2SO4(棕黑色)+SO2↑+CO2↑ 棕黑色)+SO Cu2SO4+2H2SO4 ________ 2CuSO4(蓝色) +2H2O+SO2↑ 蓝色) 消煮过程会产生大量二氧化硫和三氧化 硫,需在通风橱内进行消煮 消煮控制 消煮液呈现蓝绿色澄清后, 消煮液呈现蓝绿色澄清后,继续 加热至少半小时。

加热至少半小时。 氨 气 蒸馏 样品分解液加入NaOH, 样品分解液加入NaOH,在强碱性条件 NaOH 下蒸馏,氨逸出,全部被硼酸吸收。

下蒸馏,氨逸出,全部被硼酸吸收。 半微量凯氏定氮蒸馏装置 滴定 以盐酸标准溶液滴定。

以盐酸标准溶液滴定。根据耗酸量及其浓 算出含氮量,进而推算粗蛋白含量。

度,算出含氮量,进而推算粗蛋白含量。

指示剂:甲基红—溴甲酚绿混合指示剂。

溴甲酚绿混合指示剂。

指示剂:甲基红 溴甲酚绿混合指示剂 蓝绿色滴定至灰红色为终点 滴定至灰红色 由蓝绿色滴定至灰红色为终点 HCl标准溶液浓度

标准溶液浓度

标准溶液浓度 常量0.1mol/L, 常量 半微量0.02mol/L 半微量 空白测定 克蔗糖代替试样, 以0.5克蔗糖代替试样,耗0.05mol/L 克蔗糖代替试样 盐酸不应超0.3ml。

盐酸不应超 计算 (V2-V1)×C×0.0140×6.25 0.0140× CP(%)= (V’/V) W× (V /V) ×100% 重复性 当CP(%) >25% 允许相对偏差 1% CP( 10-25% 10<10% 2% 3% 准确性检验 以硫酸铵代替试样进行测定, 以硫酸铵代替试样进行测定, 应测得其含氮量为21.19±0.2%. 应测得其含氮量为21.19± 21.19 操作注意事项 1. 以减量法准确称样

以减量法准确称样: 将称量纸放在 天平上,然后回零 天平上,然后回零 于称量纸上称取适 量的样品,然后回零 量的样品,然后回零 将样品倒入 消化管 将称量纸放回天平, 将称量纸放回天平, 读取所显示的负值, 读取所显示的负值,即 为倒入消化管的样品重 操作注意事项 2.样品必须准确称重 而所加入的催化剂、 而所加入的催化剂、 蔗糖、 蔗糖、硫酸不必精确度量 尽量避免样品粘在消化管的管壁上 3. 消化时,消化管应盖上管帽 消化时, 在通风橱里消化样品。

在通风橱里消化样品。

开始时用小火, 开始时用小火,待泡沫 消失后加大火力。

消失后加大火力。 消煮液呈现澄清蓝绿色后,继续加热至少 消煮液呈现澄清蓝绿色后, 现行国标要求至少2小时) 半小时 (现行国标要求至少2小时) 蒸馏和滴定的操作注意事项 待续) (待续)

第一篇:粗蛋白质

油 脂 的 检 验 与 分 析 粗蛋白质的测定(凯氏半微量定氮法) 测定原理 凯氏法的基本原理是将含有蛋白质的样品与浓硫酸共热使其分解,其中氮元素 变成铵盐。

再经浓碱液作用, 放出的氨气经硼酸吸收后用盐酸标准溶液滴定硼酸溶液所吸收 的氨。计算出试样含氮量,乘以相关的蛋白质换算系数,即得打蛋白质的含量。

消化:蛋白质与浓硫酸混合加热,蛋白质被炭化分解,其中碳被氧化成二氧化碳,所含的 氮则转变成硫酸铵残留于消化液中。

有机物(含 N、C、H、O、P、S 等元素)+H2SO4 CO2 ↑ + (NH4)2SO4 + H3PO4+SO2↑+SO3↑ 由于上述反应进行的很慢,消化需要很长时间,加入催化剂可加速反应。硫酸铜是备用的催 化剂, 硫酸钾能提高硫酸的沸点, 常将它们混合使用, 起加速氧化、 促进有机物分解的作用。

蒸馏:消化所得的硫酸铵加碱蒸馏,氨就被释放出来。

(NH4)2SO4+ 2NaOH=2 NH3·H2O+ Na2SO4 NH3·H2O=NH3↑+H2O 生成的氨用硼酸溶液吸收。硼酸吸收氨后,指示剂颜色变化,再用盐酸滴定,直至恢复到原 来的氢离子浓度为止,盐酸与样品中氨是等摩尔反应。

2NH3+4 H3 BO3=(NH4)2 B 4O7+5H2O (NH4)2 B 4O7+2 HCl+ 5H2O =2NH4Cl +4H3 BO3 由于各种蛋白质的含氮量通常为 16%左右, 将含氮量乘以蛋白质系数, 即为粗蛋白质含量。 1 浓硫酸—过氧化氢—水混合液 试剂 ○ (2+3+1) 。

在 100mL 水中缓慢加入浓硫酸 200mL, 2 混合催化 冷却后加入 30%过氧化氢 300mL,混匀备用,此液存放阴凉处可保存一个月。○ 剂。10g 硫酸铜 (Cu SO4·5H2O) 、100g 硫酸钾、0.2g 硒粉,在研钵中研细, 通过孔径 0.45mm 3 40g/100mL 氢氧化钠溶液、2%硼酸溶液、0.01mol/L 盐酸溶液。○ 4 甲基 筛,混匀后备用。○ 红乙醇溶液:称取 0.1g 甲基红置于研钵中,加入少许 95%乙醇,研磨溶解后加入 75mL95% 5 次甲基蓝乙醇溶液:0.1g 次甲基蓝溶于 80mL95%乙醇中,临用时将以上两液按 2

乙醇。○ 1 比例混合即成。在酸域呈紫红色,PH=5.5 时无色,在碱域呈绿色。 仪器 50mL 凯氏烧瓶、 1000mL 圆底烧瓶、 100mL 锥形瓶、 5mL(刻度 0.01mL)微量滴定管、 50mL 容量瓶、5mL 移液管、凯氏蒸馏装置。 1 消化。用长条光滑纸称取试样 0.2~0.3g,精确到 0.0001g(约含粗蛋白 操作方法 ○ 质 10~30mg)直接送入凯氏烧瓶底部,加混合催化剂 1g,同时加入硫酸+过氧化值+水混 合液 3~5mL,稍加振摇,斜置于电炉上。在通风橱内加热进行消化。开始时用低温加热, 切勿使瓶中泡沫超过瓶肚的 2/3,待泡沫减少和烟雾变白后再增加温度保持微沸。直至消化 液呈浅蓝绿色的透明状时再继续加热沸腾 10min,取出,待消化液冷却至室温后,加水至 10~20mL。溶液温度降到室温后,将消化液移入 50mL 容量瓶中,并用少量水将凯氏烧瓶 冲洗 3~4 次,洗涤液一并移入容量瓶中,加水稀释至刻度,混匀备用。 2 蒸馏。凯氏微量蒸馏装置它是由蒸汽发生器、反应瓶、及冷凝管等组成,在大烧瓶 8 ○ (容量 1000 mL)中加入蒸馏水 400mL 和少量碎玻璃片,加 5 滴混合指示剂,加几滴酸液, 使水呈紫红色,盖紧瓶塞,连接 4、1、2 并检查有无漏气。量取 30mL2%硼酸溶液,注入 (100mL)三角瓶 3 内,作为承接器,加混合指示剂 1~2 滴(溶液呈紫红色) ,置于冷凝管 2 下面,使管尖端插入硼酸溶液 1cm 深处。用 5mL 移液管吸取 5mL(V)试样稀释液,由漏斗 5 注入蒸馏瓶 1 内, 再倒入蒸馏水 10mL 冲洗漏斗 5。

接着量取 40g/100mL 氢氧化钠溶液 10mL, 由漏斗 5 注入蒸馏瓶 1 内,再用 2~5mL 水冲洗漏斗 5,旋紧活塞,此时蒸馏瓶 1 内溶液总 体积应不超过容积的一半。 打开电炉加热烧瓶 8,打开簧夹 7,关闭活塞 6,使蒸汽通过回流管 4 进入蒸馏瓶 1 再由 蒸馏瓶 1 经冷凝管 2 而流入三角瓶 3, 待三角瓶 3 内的溶液呈绿色时, 开始记录时间, 经 2~ 3min 后,将三角瓶 3 放低,使冷凝管 2 下端离开液面,继续蒸馏 1min,然后用少量无 CO2 蒸馏水冲洗冷凝管 2 下端,蒸馏即告结束。

蒸馏结束后,旋紧簧夹 7 断绝蒸汽。这时由于回流管 4 内蒸汽压立即降低,所以蒸馏瓶 1 内的液体则全部吸入回流管 4 内。然后打开漏斗 5 下的簧夹,注入蒸馏水 40~50mL 于蒸 馏瓶 1 内,关闭漏斗 5 下的簧夹,打开簧夹 7,通入蒸汽加热洗涤蒸馏瓶 1,再断绝蒸汽, 使洗涤回流至回流管 4 中,打开活塞 6,将回流管 4 中废液弃去,关闭活塞 6,为下次蒸汽 做好准备。 3 滴定。用 0.01mol/L 盐酸标准溶液滴定三角瓶 3 中的吸收液至出现淡紫色为止。记录 ○ 所消耗盐酸标准溶液的体积(V1) 。 空白试验除不加试样外,消化、蒸馏、滴定操作与样品相同。 结果计算 粗蛋白质的干基含量按下式计算: (V2-V1) ·c×0.0140×6.25 W(%)= V′ m× V ×100 式中 V2----滴定试样时所需标准盐酸溶液的体积,mL; V1----滴定空白时所需标准盐酸溶液的体积,mL; c-----盐酸标准溶液浓度,mol/L; m------试样的质量,g; V------试样分解液总体积,mL; V′---试样分解液蒸馏用体积,mL; 0.0140-----与 1.00mL 盐酸标准溶液「c(HCl)=1.000mol/L」相当的以克表示 的氮的质量。

6.25-----氮换算成蛋白质的平均系数。 双实验结果允许差:粗蛋白质含量在 15%以下时,不超过 0.2%;粗蛋白质含量在 15%以 上时,不超过 0.4%。求其平均数,即为测定结果,测定结果取小数点后一位 粗蛋白质(%)=

第一篇:粗蛋白质

狭义来讲, 提取指制备物与细胞固体成分或其它结合成分的分离, 由固相转入液相或从细胞内生 理状态转入外界特定溶液环境的过程, 即分离前期被提取物从破碎的细胞中释放出来的过程。

如 果被提取物程固相或与固体结合,提取时由固相转入液相,常称为固液萃取;如果被提取物已经 呈液相存在,提取时由一液相转入转作文入另一互不相溶的液相,这种方法称为液液萃取。

广义来讲,提取又可称为抽提或萃取,贯穿在整个分离纯化过程中,如核酸制备中用氯仿或 苯酚反复抽提除去蛋白质,分离 DNA 和 RNA。

提取的好坏受到多种因素的影响,包括

1)溶液 涉及到溶液中的保护成分、离子强度、PH 值、温度、表面活性剂、变性剂(如尿 素和盐酸胍)和粘稠度、溶液的更换; 2)材料 包括材料本身固有的特性、材料的选择和处理; 3)目的分子 目的分子的理化性质、存在方式和部位、含量; 4)其它因素 搅拌、提取时间的长短。

第一节 溶剂和溶解度 一. 溶剂 一些常用溶剂按其极性的大小,可依顺序大体排列如下:饱和烃类<全卤代烃类<不饱和烃 类<醚类<未全卤代烃类~脂类<酮类<醇类。

还可按形成氢键能力的大小,分为五类

1)能形成两个以上氢键的溶剂分子 如水,其两个氢原子和一个氧原子都可以形成氢键; 2)能形成两个氢键的溶剂分子 既是氢键的供体又是氢键的受体,例如脂肪族的醇类; 3)只作质子受体的溶剂分子 如脂肪族的醚类; 4)只作质子供体的溶剂分子 如氯仿; 5)不能形成氢键的烃类 如四氯化碳。

1)和 2)两类溶剂宜用于极性化合物的提取,3)和 4)两类溶剂宜用于对溶液中弱极性或 非极性化合物的提取。

二.溶解度 溶解度用于分离提纯有两个主要目的:1)选择一个对制备物溶解度大而对杂质溶解度小的 溶剂,使制备物从组分中有选择地被孤立出来;2)或选择一个对制备物溶解度小而对杂质溶解 度大的溶剂,使制备物从组分中沉淀或结晶出来。

1. 物质溶解性质的一般规律可归纳为如下几点

1)极性物质易溶于极性溶剂中,非极性物质易溶于非极性溶剂中; 2)碱性物质易溶于酸性物质中,酸性物质易溶于碱性物质中; 3)在极性溶液中,溶剂介电常数的减少伴随溶质溶解度的降低。

总之,符合"相似相溶"原则。

2. 影响物质溶解度的几个主要因素

1)离子强度 A.有些物质,如 DNA-蛋白,在高离子强度下溶解度增加。

B.另一些物质,如绝大多数球蛋白和酶,在低离子强度下溶解性增加,称为盐溶;而在高 离子强度下溶解度下降,直至出现沉淀,称为盐析。

C.盐溶现象不仅在水溶液中发生,而且在低介电常数溶剂,如乙醇,也同样发生。故而稀 盐液常用于大多数生化物质的提取。

2)PH 值 A.两性溶质分子,在等电点时易相互聚集,溶解度最低;而在远离等电点两侧的 PH 值时, 溶解度增大。

B.一些酸性或碱性小分子物质,在 PH 值很低时酸性物质呈现非解离分子状态,而碱性物 质呈现阳离子状态;反之,酸性物质呈现阴离子状态,而碱性物质呈现非解离分子状态。离子状 态的物质,不论是阳离子或阴离子都易溶于水,非离子的分子状态则易溶于有机溶剂。

C.对蛋白质、酶、核酸等生物大分子来说,应避免过酸或过碱,一般控制在 PH6-8 范围。

如单纯从溶解度考虑,等电点在酸性范围的蛋白或酶,可选用偏酸性溶液提取;等电点在碱性范 围内,则选用偏酸性溶液提取,酸性条件还可解离目的蛋白与其它组分形成的离子键,并有利于 细胞的溶解。

3)温度 A.温度的提高可增高物质的溶解度,减少溶液的粘度,有利于提取的进行。对于一些植物 成分或某些小分子生化物质,提取温度常在 50-70 度。

B.热提取法虽然提高提取效率,但所得提取液含杂质较多,不如冷提取法。对绝大部分生 物大分子而言,提取温度一般控制在 0~10 度之间,以防止生物大分子的变性。

4)去垢剂 去垢剂(表面活性剂)是一类即具有亲水基又具有疏水基的物质,一般具有乳化、分散、和增溶作 用,可分阴离子、阳离子和中性去垢剂等多种类型,中性去垢剂在蛋白提取钟应用的较多。

A.中性去垢剂 又称非离子表面活性剂,对蛋白质的变性作用影响较少,宜于蛋白质或酶提取 之用。一般市售中性去垢剂有聚乙二醇类,如 PEG200;多元醇类表面活性剂,如山梨醇、司盘 类和吐温类;聚氧乙烯脂肪醇醚,如苄泽类、平平加类;聚氧乙烯烷基苯酚醚,如 Igepal CO、 乳化剂 OP、Triton、Pluronic(用作消泡剂、润湿剂、增溶剂)、泡敌。中性去垢剂作用后可通过 Sephadex LH-50 柱除去;也可直接上 DEAE-Sephadex 柱层析分离目的蛋白,不必先除去去垢 剂。

B. 阴离子去垢剂 常见的有十二烷基硫酸钠和十二烷基璜酸钠。

前者可促进核蛋白的溶解, 将核酸释放出来,并对核酸酶有一定抑制作用,常用于核酸的提取。

C.阳离子去垢剂 如洁尔灭、新洁尔灭、CTAB、CPC、ZEPH、克菌定、消毒净(TMPB)、杜 灭芬等,消毒灭菌类居多。

D.天然表面活性剂 又称为生物表面活性剂,包括种类较为广泛,如各种树胶(阿拉伯胶、 杏胶、桃胶、果胶)、明胶、皂甙、卵磷脂、豆磷脂、琼脂、海藻酸钠、酪蛋白、胆甾醇、胆酸 类、多糖类(如环糊精)等。

E.两性表面活性剂 在碱性水溶液中呈阴离子表面活性剂的性质,起泡性好,去污力也强; 在酸性溶液中则呈现阳离子表面活性剂特征,其杀菌性很强。

5)变性剂 蛋白质变性剂的作用是破坏蛋白质的次级键, 如氢键、 盐键和疏水力, 引起天然构象的解体; 它们并不破坏共价键,如肽键和二硫键,故不涉及一级结构的改变。变性剂有溶解型和沉淀型两 类,SDS、尿素和胍盐是有效的溶解型变性剂,而三氯乙酸、甲醇、和氯仿/异戊醇是有效的沉 淀变性剂。一般而言,变性剂应用时常大大过量,破坏氢键的变性剂用量至少两倍于氨基酸的克 分子数,如 1 克蛋白质可可结合 1.4g。

SDS 溶于水可达 25%,对温度敏感,W/V 贮存液最为 方便。需要注意的是 SDS 的钾盐是不溶性的,所以 SDS 溶液中要避免混入钾盐。

尿素极易溶 于水,可达 10mol/L,在 8mol/L 以上要注意温度以防止沉淀。尿素在水中缓慢分解形成氨及高度 活性的氰酸离子,故要防止高温。

三氯乙酸与过氯酸(TCA,PCA)都是极好的沉淀剂,能沉 淀蛋白质和核酸,前者应用更为广泛。

第二节 提取方法 一.固液萃取 在固液萃取中,提取物是由固相转为液相,或由细胞内转为细胞外,其提取效率与物质的扩 散作用有关。

为了增加扩散物质的量,也就是提高提取速度,常采用如下措施

1)提高材料的破碎程度,以增加扩散面积,减少扩散距离; 2)进行搅拌,使已扩散的溶质迅速与溶剂混匀,以保持两项界面最大浓度差,或分多次提 取,不断更换新鲜溶剂,以提高扩散速率; 3)延长提取时间,提高提取温度,以及减少溶液粘度(如属大分子核酸干扰,加入少量鱼 精蛋白或硫酸链霉素沉淀除去)等。

实际上从破碎后的固体细胞提取所需组分, 当细胞破碎程度及提取温度受到限制时, 采用少 量多次提取方法较为有利。

二.液液萃取 液液萃取选用的溶剂必须与被抽提的溶液互不混合、 且对被抽提的溶质有选择性的溶解能力。

最 常用的液液萃取溶剂为二相溶剂,水或水-醇为一相,与水互不相溶的各种碳氢化合物,如低级 醚、酯、苯酚等,为另外一相。

第三节 蛋白质和酶的提取分离 一.蛋白质及其溶解性质 蛋白质有多种分类方法

1) 按其功能 活性蛋白和非活性蛋白 2) 按其结构 简单蛋白和结合蛋白 3)按其溶解度 水溶性蛋白、醇溶蛋白、硬蛋白(不溶于水、稀酸、稀碱和有机溶剂,遇 强酸或强碱溶解)。一般来说,大部分蛋白可溶于水、稀酸、稀碱或稀盐溶液,少数与脂类结合 的蛋白质则溶于乙醇、丙酮、丁醇等有机溶剂。

二.蛋白质的一般提取方法 1. 水溶液提取 凡能溶于水、稀盐、稀酸或稀碱的蛋白质,一般可用稀盐或缓冲溶液进行提取,稀盐溶液和 缓冲溶液,有利于稳定蛋白结构和增加蛋白质溶解度。

此时应考虑以下因素

1)提取液体积 加入量太少则提取不完全,加的过多则不利于浓缩,一般为原材料的 3-6 倍的体积,可一次或分次提取。

2) 盐浓度 一般在 0.02-0.2M 的范围内, 常用的稀盐和缓冲液有 0.02-0.05M 磷酸盐缓冲液、 碳酸盐缓冲液、0.09-0.15M 的氯化钠等。在某些情况下,也用到较高的盐浓度,如提取脱氧核 糖蛋白及膜蛋白。

有时为了螯合某些金属离子和解离酶分子与其它分子的静电结合, 选用柠檬酸 缓冲系统和焦磷酸缓冲液可获得较好效果。

3)pH 值 一般在被提取蛋白质的等电点的两侧,碱性蛋白用稀酸提取、酸性蛋白用稀碱提 取。在某些情况下,为了破坏所分离的蛋白质与其他杂质的静电结合,选择偏酸(pH3-6)或偏 碱(pH10-11),可以使离子键破坏而获得单一的蛋白成分。

4)温度 提取时通常要求低温操作。只有对某些耐高温的蛋白质或酶(如胃蛋白酶、酵母 醇脱氢酶及某些多肽激素。 5)提取时常缓慢搅拌,以提高提取效率 6)有时为了破坏蛋白质与其它物质的离子键或氢键的结合,加入少量的多价阴离子也有助 于蛋白提纯。

2. 有机溶剂提取 一般和脂质结合比较牢靠或分子中非极性侧链较多的蛋白质和酶,难溶于水、稀酸、稀盐和 稀碱,常用有机溶剂提取。他们同时有亲脂性和亲水性,如丙酮、异丙醇、乙醇、正丁醇等。其 中正丁醇应用的较为广泛, 能在水和脂分子间起着类似去污剂的桥梁作用, 由于丁醇与蛋白质极 性基团结合的竞争力比脂质大, 所以可取代蛋白质与脂质的结合位置, 使原来蛋白质在水中溶解 度大大增加。

有些蛋白和酶即能溶于稀酸、稀碱,又能溶于一定比例的有机溶剂。在这样的情况下,采用 稀的有机溶剂提取可防止水解酶的破坏,并兼容除杂和提高提取效果的作用,现举例说明

胰岛素可溶于稀酸、稀碱和稀醇溶液,针对组织中共存的糜蛋白酶对胰岛素有极高的水解活性, 可采用 68%酒精溶液并用草酸调至 PH2.5-3.0,这样便能在三方面抑制了糜蛋白酶的活性

1)68%酒精可以使糜蛋白酶暂时失活; 2)草酸可以除去激活糜蛋白酶的金属离子钙; 3)PH2.5-3.0 是糜蛋白酶不适于作用的 PH 值。

而以上条件对胰岛素的溶解度和稳定性并没有影响, 并可以除去一部分在稀酸及稀醇中不溶解的 杂蛋白 垂体前叶 ACTH 常采用酸性 70%丙酮,其设计原理是酸性可以促使 ACTH 的溶解,而 70%浓度 丙酮对 ACTH 的溶解度没有影响, 却大幅度地降低其他杂蛋白的溶出, 对提高分离纯化的效果极 为明显。

3. 从细胞膜上提取水溶性的蛋白质和酶方法

膜上的蛋白质或酶一般有两种存在方式:一种在膜表面上,与膜成分结合较松,经过充分粉碎细 胞, 在一定 PH 范围用稀盐溶液即可提取分离; 一种是膜的内在成分之一, 或与膜结合十分紧密, 提取十分困难,需用超声波、去污剂、或其他比较强烈的化学处理,一般常用方法有如下几种

1)浓盐或尿素等溶液提取 如 NaClO4、尿素、盐酸胍等。当以上溶液浓度达到 2M 时,可抽去 27%以上的膜蛋白,但这样的条件易引起蛋白质和酶的变性。

2)碱溶液提取 在 PH8-11 范围内,某些膜蛋白随着 PH 值的提高而溶解度大大增加,但碱提取 法也容易引起蛋白酶和酶的失活,应用上不广。

3) 加入金属螯合剂 蛋白质通过金属离子与膜成分结合时, 加入金属螯合剂如 EDTA 可使蛋白质 释放出来。

4)有机溶剂提取 使用乙醇、吡啶、叔戊醇、正丁醇是抽提膜上结合或内在脂蛋白最常用也最 为有效的方法。如正丁醇可在广泛的 PH 值(3-10)温度范围内(-2- +40)内使用。

5) 去垢剂处理 用去垢剂分离膜蛋白时, 要考虑两点要素, 去垢剂的溶解能力和去垢剂的温和性。

强阴离子去垢剂,如 SDS,一般具有很好的溶解性能,但温和性不够理想,容易引起蛋白质变 性;弱离子型或非离子型去垢剂对蛋白变性影响较小,但溶解能力较差。根据报道,Triton 100 用于提取 ADP/ATP 载体蛋白时, 由于作用较为温和, 故所得蛋白活性要高于使用其他去污剂。

去 垢剂的溶解能力与溶液的离子强度有关,一般说两者呈现正比关系。

第四节 提取时的保护性措施 提取一些具有生理活性的物质时, 除了考虑被提取物溶解度外, 还应考虑被提取物活性的保 护。对于一些生物大分子如蛋白质、酶和核酸来说,主要措施有如下几点; 1.采用缓冲系统 防止提取过程中某些酸碱基团的解离,造成溶液中 PH 值变化幅度过大,导致 某些活性物质的变性、或由于 PH 变化影响提取的效果。在生化制备中,提取中常用的缓冲系统 有磷酸盐缓冲液、 柠檬酸缓冲液、 Tris 缓冲液、 醋酸盐缓冲液、 碳酸盐缓冲液和巴比妥缓冲液等。

[缓冲液] 分为非-双性离子缓冲化合物类和双性离子缓冲化合物类。前者包括 HCl-KCl、甘 氨酸-HCl、乌头酸盐-NaOH、柠檬酸盐-磷酸盐、柠檬酸盐-NAOH、醋酸盐、琥珀酸盐、顺丁烯 二酸盐-NAOH、磷酸盐、TRIS-HCL、硼酸-硼砂、甘氨酸-NAOH、碳酸盐-碳酸氢盐等,存在反应 性和缓冲能力有限等缺点。

双性离子缓冲液虽然具有很多优点, 但依然存在反应性与不适应性的 问题,如 HEPEs 是氨基丁酸的拮抗性(反应性)、不适应于所有的组织培养(不适应性)。

2.加入保护剂 防止某些生物活性物质的活性基团及酶的活性中心受到破坏。如最常见的 巯基,是许多活性物质和酶催化的活性基团,极易被氧化,故提取时常加入一些还原剂。一些易 受重金属离子抑制生理活性的物质,加入某些金属螯合剂,把有害金属离子螯和掉,而保持被提 取物的活性。

[螯合剂和巯基试剂] 巯基试剂在生化反应中有两个用途,一是防止蛋白质或酶等 分子中的 SH-基氧化成 S-S,二是某些酶反应中维持体系的还原环境。经常应用的巯基试剂有二 硫丁醇类化合物(如二硫苏糖醇 DTT、二硫赤酰糖醇 DTE)和 2-巯基乙醇,谷胱甘肽也经常应 用。一般来说二硫丁醇类是常选用的巯基试剂,不仅是因为挥发性低,难闻的气味较少,而且氧 化电位低,比 2-巯基乙醇浓度低很多的情况下,可以使其他二硫化合物完全还原。螯合剂用于 控制反应中金属离子浓度或去除金属离子,常用的螯合剂有 EDTA(乙二胺四乙酸)、EGTA、 1,10-二氮杂菲、柠檬酸和磷酸等。

3.抑制水解酶的破坏 根据不同水解酶的性质采用不同方法。如需要金属离子激活的水解 酶,常加入 EDTA 或用柠檬酸缓冲液除去溶液中的某些金属离子,使酶的活性受到抑制;对热不 稳定的水解酶,可以用热提取法使之失去作用;或选用 PH 范围,使酶活性最低;还可针对性地 加入某些抑制剂,以抑制水解酶的活性,但此类方法在蛋白提取中应用较少。

4.其它一些特殊要求的保护措施 除避免紫外线、强烈搅拌、过酸过碱、高温、冻结等情 况外,有些蛋白质在提取时还有特殊要求,如固氮酶钼-铁蛋白,必须在无氧条件下进行。

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